Använda GAL4-UAS-systemet för funktionell genetik i Anopheles gambiae

Summary

Tvåpartssystemet GAL4-UAS är ett mångsidigt verktyg för modifiering av genuttryck på ett kontrollerat spatiotemporalt sätt som tillåter funktionell genetisk analys i Anopheles gambiae. De förfaranden som beskrivs för att använda detta system är en halvstandardiserad kloningsstrategi, sexning och screening av puppar för fluorescerande proteinmarkörer och embryofixering.

Abstract

Tvåpartssystemet GAL4-UAS är ett mångsidigt och kraftfullt verktyg för funktionell genetisk analys. Kärnan i systemet är att korsa transgena “förarlinjer” som uttrycker jäst transkriptionsfaktorn GAL4 på ett vävnadsspecifikt sätt, med transgena “responder” linjer som bär en kandidat gen / RNA interferens konstruktion vars uttryck styrs av Uppströms aktiveringssekvenser (UAS) som binder GAL4. I den efterföljande avkomman uttrycks genen eller ljuddävarekonstruktionen således på ett föreskrivet spatiotemporalt sätt, vilket gör det möjligt att analysera de resulterande fenotyperna och genfunktionen härledas. Det binära systemet möjliggör flexibilitet i experimentella metoder för att screen fenotyper genereras av transgene uttryck i flera vävnad-specifika mönster, även om allvarliga fitness kostnader induceras. Vi har anpassat detta system för Anopheles gambiae, den viktigaste malariavektorn i Afrika.

I den här artikeln tillhandahåller vi några av de vanliga procedurer som används under GAL4-UAS-analysen. Vi beskriver An. gambiae GAL4-UAS linjer som redan genereras, liksom kloning av nya responder konstruktioner för upregulation och RNAi knockdown. Vi anger en steg för steg guide för sexing av myggpuppar för att upprätta genetiska kors, som också inkluderar screening avkomma för att följa arv av fluorescerande genmarkörer som taggar föraren och responder insättningar. Vi presenterar också ett protokoll för att rensa An. gambiae embryon för att studera embryonal utveckling. Slutligen introducerar vi potentiella anpassningar av metoden för att generera förarlinjer genom CRISPR/Cas9 införande av GAL4 nedströms målgener.

Introduction

Bipartite GAL4-UAS-systemet är arbetshästen för funktionell karakterisering av gener i insektsmodellorganismen Drosophila melanogaster1,2,3. För att använda GAL4-UAS-systemet korsas transgena förarlinjer, som uttrycker jäst transkriptionsfaktorn GAL4 under kontroll av en reglerande sekvens, med responderlinjer som bär en gen av intresse eller RNA-interferens (RNAi) konstruktion som styrs av en uppströms aktiveringssekvens (UAS) som erkänns av GAL4. Avkomman till detta kors uttrycker det transgene av intresse i ett spatiotemporal mönster dikteras av promotorn som kontrollerar GAL4 uttryck (figur 1). Fenotyper som visas av avkomman av förar-responder kors kan bedömas för att klargöra funktionen av kandidat gener. Även om D. melanogaster har använts för att undersöka gener från andra organismer4,5,6,7, har GAL4-UAS-systemet nu anpassats för användning i insekter av medicinsk och jordbruks betydelse för att ge direkt analys av arten av intresse 8,9,10,11,12,13,14.

I den afrikanska malariamyggan, Anopheles gambiae, testades GAL4-UAS-systemet först av cellinjen co-transfection9. Flera konstruktioner analyserades för effektivitet i olika parvisa kombinationer och fann att 14 tandem upprepade UAS kompletteras med en liten konstgjord intron (UAS-14i) visade det bredaste utbudet av aktiveringspotential när den används med en panel av GAL4 förare. För att demonstrera in vivo-funktionalitet användes dessa konstruktioner sedan för att skapa två separata transgena An. gambiae-linjer genom PiggyBac ^{transformation8}: en förarlinje som bär GAL4 som drivs av en midgutspecifik promotor och en responderlinje som innehåller både luciferas och förbättrade gula fluorescerande proteingener (eYFP) under reglering av UAS-sekvenser. Gut specifika luciferas aktivitet och fluorescens i avkomman anges att systemet var effektivt i Anopheles. Sedan dess har förarlinjer skapats som uttrycker transgener i andra vävnader som är viktiga för vektorkapacitet och insekticidbeständighet, inklusive ^äggocyter15 och hemocyter16, och i ett nära allestädes närvarande ^mönster10. Många UAS linjer har också genererats för att analysera gener som tros vara inblandade i metabolism och bindning medierad insekticid resistens, cuticular kolväte syntes och att fluorescerande märka olika cell- och vävnadstyper (tabell 1). För responderlinjerna utförs platsstyrd integration av transgenen nu av ΦC31 katalyserad rekombinationskassettutbyte17,18 för att fixa det genomiska sammanhanget för de UAS-reglerade generna. På detta sätt normaliseras transgene uttryck när det gäller genomisk insättning plats, vilket möjliggör mer exakt jämförelse av de fenotypiska effekterna av olika kandidat gener.

De svarande linjer som skapats hittills är utformade för att antingen uttrycka transgen antingen på förhöjda nivåer eller för att minska genuttrycket genom RNA-interferens (RNAi). Vanligtvis cDNA kloner smälts till UAS sekvensen för att generera lämpliga uttryck plasmider, men full genomiska sekvenser är också genomförbara förutsatt att de inte är för stora för kloning. För att generera ljuddämpningskonstruktioner har vi använt tre olika metoder för att få lämpliga tandem inverterade sekvenser som bildar hårnålsdsRNA som stimulerar RNAi. Dessa har inkluderat fusion PCR, asymmetrisk PCR och kommersiell syntes av hårnål konstruktioner. Gemensamt för varje metod är införandet av en intronsekvens mellan de inverterade sekvenserna för att ge kloningsstabilitet. Responderplasmider i vilka en gen av intresse/RNAi konstruktion kan sättas in har ^utvecklats15. Dessa plasmider bär också de nödvändiga ΦC31 attB-platserna för RMCE (beskrivs i Adolfi medföljande JoVE-papper som beskriver RCME-tekniken i detalj). Protokoll som täcker de viktiga steg som krävs vid val av sekvens för införande i en av dessa plasmider för överuttryck ingår i detta manuskript. Dessutom beskrivs och illustreras två protokoll för RNAi hårnål konstruktion skapande.

När man skapar nya linjer är identifiering av sällsynta transgena individer avgörande att odla från för att etablera och upprätthålla transgena kolonier. Viktigast av allt för GAL4-UAS-systemet är det nödvändigt att skilja responder- och förarlinjerna för att upprätta kors och identifiera enskilda avkomlingar som bär båda transgenerna. Detta uppnås genom att använda olika dominerande valbara markörgener kopplade till drivrutins- och svarande kassetter. Oftast är dessa fluorescerande markörgener som är tydligt urskiljbara med optiska filter (t.ex. eYFP, eCFP, dsRed). Det är viktigt att markörer uttrycks i ett känt och tillförlitligt spatiotemporal mönster eftersom detta gör identifiering av avvikelser och förorening lättare. Fluorescerande markör genuttryck regleras rutinmässigt av den syntetiska 3xP3 promotorn, vilket orsakar öga och ventrala ganglier specifika uttryck i alla stadier av An. gambiae ^utveckling19. Fluorescerande markörer som styrs av 3xP3 ingår i alla omvandlingsplasmider som beskrivs i denna artikel. Ett protokoll som beskriver de vanliga metoderna som används för att screena fluorescerande An. gambiae pupae GAL4-UAS linjer ingår här.

En av de viktigaste delarna i GAL4-UAS-systemet är behovet av att korsa de differentiellt markerade förar- och svarandelinjerna. För att göra detta måste hane och kvinnor från varje linje separeras före parning. Vuxna kan dock lätt urskiljas genom syn, men för att upprätta genetiska kors är det klokt att separera könen före vuxenuppkomsten för att säkerställa att parning inte har skett. Den allmänna storleksskillnaden mellan manligt och kvinnligt An. gambiae pupae är för varierande för att vara en effektiv och pålitlig metod för ^{könsbestämning20}. Istället ger tydliga morfologiska skillnader i de yttre könsorganen en tillförlitlig grund för sexing i An. gambiae. I den här artikeln beskriver vi en pålitlig metod för sexing An. gambiae pupae för att ställa in lämpliga kors.

Figur 1 – Diagrammatisk framställning av processen för användning av tvåparts-GAL4-UAS-systemet i Anopheles gambiae. (A) Huvudkomponenterna i en exempelvektor (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]) avbildas och beskriver tillgängliga begränsningsplatser (EcoRI, NheI, XhoI och NcoI) inom de flera kloningsplatser som är lämpliga för användning för att sätta in hårnålskonstruktionen eller kodningssekvensen för den av intressegenen. Dockningslinjens struktur avbildas också. (B) Gränssteget illustreras som anger användningen av hanar från förarlinjen (som transporterar GAL4-föraren av en initiativtagare av intresse och eCFP som drivs av 3xP3-promotorn) och kvinnor från den svarande linjen (som bär den gen av intresse eller hårnålskonstruktion som kontrolleras av en UAS-promotor och en eYFP-markör som kontrolleras av 3xP3-promotorn). C) En diagrammatisk framställning av GAL4 drivande uttryck av genen av intresse för avkomman av korset i B och en lista över några av de typiska fenotyper som bedöms. Förkortningar: Multiple Cloning Site (MCS), Recombinase medierat kassettutbyte (RMCE), Upstream Activator Sequence (UAS), förbättrat gult fluorescerande protein (eYFP), förbättrat cyan fluorescerande protein (eCFP). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Det är användningen av kors som ger GAL4-UAS-systemets tvåpartskaraktär, som har tydliga fördelar jämfört med mer linjära metoder. Till exempel kan många fler kombinationer av förar- och svarande linjer bedömas än vad som skulle vara möjligt om en ny transgen linje måste genereras och bibehållas för varje promotor/genkombination. Ännu viktigare är att det tillåter analys av gener som producerar dödliga eller sterila fenotyper när deras uttryck är stört som är svåra att skapa /underhålla i ett linjärt system. Sådana dödliga fenotyper kan manifestera sig i alla utvecklingsstadier, beroende på genfunktionen och spatiotemporal uttryck, men observeras oftast under embryonal utveckling. Visualisering av myggembryonutveckling kräver att man rensar den ogenomskinliga chorion som täcker äggen. Efter metoder som beskrivs i Trpiš (1970)²¹ och Kaiser et al. (2014)²² beskriver vi de protokoll vi använder för att fixa embryon, samtidigt som den strukturella integriteten upprätthålls och blekning för att rensa endochorion som möjliggör mikroskopisk visualisering och avbildning.

Protocol

1. Konstruktion och konstruktion av UAS-konstruktioner Design och montering av vektorer för kandidatgenuttryck Bestäm sekvensen som ska användas för uppreglering av kandidatgenen. Sekvens cDNA/gDNA från intressebelastningen och jämför den med den publicerade sekvensen för att verifiera dess identitet och identifiera potentiella SNPs och begränsningsplatser för diagnostisk sammandrag. Se till att den främre primern som används för genf?…

Representative Results

3xP3 uttryck av eYFP, dsRed och eCFP ger tillförlitlig, lätt urskiljbar identifiering av individer som har markörgener som producerar uttryck i ögon och ventrala ganglier i An. gambiae pupae (figur 3). Den differentialmorfologi som observerats i manliga och kvinnliga yttre könsorgan som används för sexing och ett exempel på en oidentifierbar puppar markeras i figur 4. Avlägsnande av allt vatten från poppar ökar könssvårigheterna ef…

Discussion

Att förstå mygggenfunktionen är avgörande för att utveckla nya metoder för att kontrollera Anopheles och påverka malariaöverföringen. GAL4-UAS-systemet som beskrivs är ett mångsidigt och kraftfullt system för funktionell analys av kandidatgener och hittills har vi använt systemet för att undersöka den genetiska grunden för insekticidresistens17 och cuticular kolväteproduktion15,23, samt för att fluorescerande märka olika myggcellspopulationer8<sup class="xref…

Materials

100 x 15 mm plastic Petri dish	SLS	2175546	Pack of 10
1000 µL Gilson Pipette	Gilson	F144059P
20/25 mL Universal Tubes	Starlab	E1412-3020	Pack of 400
3 mL Pasteur Pipettes	SLS	G612398	Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped
50 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	11512303
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-500	500 mL
Acetic Acid	SLS	45726-1L-F	1 L
Cages	SLS	E6099	30x30x30 with screen port
Fine Paint Brushes	Amazon	UKDPB66	KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)
Fish food	Amazon		Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L
Formaldehyde Solution	Sigma Aldrich	F8775
Mouth Aspirator	John Hock	612
Pond Salt	Amazon		Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L
Pupae Pots	Cater4you	SP8OZ	250 pots with lids
Small Plastic Buckets	Amazon		2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10)
Sodium Hypochlorite	Fisher Scientific	S25552