Systematisk poänganalys för tarminflammation i en murin dextran natriumsulfatinducerad kolitmodell
Summary
Systematisk poängsättning av intestinala inflammation med hjälp av ett gratis datorassisterat system är ett kraftfullt verktyg för att kvantitativt jämföra histopatologiska förändringar i kolitmodeller som kännetecknas av förekomsten av sår och inflammatoriska förändringar. Histologisk kolit poäng utvärdering stärker kliniska observationer och underlättar data tolkning.
Abstract
Murine colitis modeller är verktyg som används i stor utsträckning i studier fokuserade på att förstå patobiologin hos inflammatoriska tarmsjukdomar. Robusta standarder för objektiv och reproducerbar kvantifiering av sjukdomens svårighetsgrad återstår dock att definiera. De flesta kolit analys metoder förlitar sig på begränsad histologisk poängsättning av små segment av tarm, vilket leder till partiella eller partiska analyser. Här kombinerar vi högupplöst bildförvärv och longitudinell analys av hela tjocktarmen för att kvantifiera tarmskada och ulceration i dextran natriumsulfat (DSS) inducerad modell av murin kolit. Detta protokoll möjliggör generering av objektiva och reproducerbara resultat utan omfattande användarutbildning. Här ger vi omfattande information om provberedning och bildanalys med hjälp av exempel på data från DSS inducerad kolit. Denna metod kan enkelt anpassas till andra modeller av murin kolit som har betydande inflammation i samband med slemhinneskada. Vi visar att fraktionen av inflammerade/skadade och eroderade/ulcerated slemhinnan i förhållande till hela längden av kolon nära paralleller kliniska resultat såsom viktminskning bland DSS-inducerad sjukdom progression. Detta histologiska protokoll ger en tillförlitlig tid och kostnadseffektivt stöd för att standardisera analyser av sjukdomsaktivitet på ett opartiskt sätt i DSS-kolitexperiment.
Introduction
Den gastrointestinala epitelbarriären spelar en avgörande roll vid separation av luminala antigener och patogener från underliggande vävnadsutrymmen1. Epitelskada och slemhinnor som ses i patologiskt tillstånd såsom inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), ischemi eller kirurgisk skada är förknippade med kliniska symtom som inkluderar diarré, viktminskning, blod i avföring och buksmärta. Som svar på skada migrerar epitelceller och förökar sig för att åter epitelialisera och reparera slemhinnor barriär defekter. Upplösning av inflammation och upprättelse av slemhinnor integritet är avgörande för att återupprätta intestinala slemhinnan homeostas och funktion2,3,4.
Olika djurmodeller har använts för att studera de underliggande molekylära mekanismerna som är förknippade med skadorna på tarmepitela barriären. Väletablerade och lätt tillämpliga modeller av kemiskt inducerad kolit används ofta, särskilt i studier relaterade till inflammatorisk skada som IBD. En vanlig, reproducerbar och pålitlig murin kolit modell använder dextran natriumsulfat (DSS) medierad colonic skada och inflammation. Svårighetsgraden av sjukdomen varierar beroende på musstam, dos av DSS, längden på DSS-administrering och molekylvikten för DSS5,6,7.
Intestinala slemhinnor under DSS kolit utvärderas vanligtvis med hjälp av Disease Activity Index (DAI), en sammansatt poäng som bestäms av viktminskning, fekal blodhalt och avföring konsistens. Fekalblodhalten kan vara mikroskopisk (detekteras med hjälp av ett avförings guaiac acid test) eller makroskopisk; fekal konsistens klassificeras som hård, mjuk eller flytande (dvs. diarré)5,8. Poängsättning av dessa kliniska parametrar kan vara subjektiv och kan variera beroende på användarens erfarenhet och partiskhet, även om uppgifterna totalt sett ger tillförlitlig information och används därför i stor utsträckning av IBD-forskare. Däremot finns det ingen allmänt accepterad metod för histologisk utvärdering av slemhinnor skador. Oftast inspekteras utvalda områden i tjocktarmen av en utbildad patolog och poängsätts baserat på flera parametrar som vanligtvis inkluderar kryptskada och leukocytinfiltration9,10,11. Men eftersom antalet undersökta parametrar och mängden vävnad som analyseras varierar avsevärt mellan enskilda rapporter, är jämförbarheten hos många publicerade studier begränsad. För att minska observatörens partiskhet och förbättra överensstämmelsen mellan studier bör ett idealiskt histologiskt poängprotokoll: 1) omfatta hela tjocktarmens längd, eftersom tarmslemhinnainflammation oftast är variabel och hoppa över lesioner är vanliga, 2) begränsa analysen till specifika nyckel- och lätttolkande parametrar för att minska subjektiviteten, 3) underlätta snabb, konsekvent bearbetning av ett stort antal prover och 4) använda allmänt tillgängliga och prisvärda verktyg för datainsamling, analys och presentation.
Här beskriver vi en teknik för att bearbeta hela tjocktarmen eller långa segment av tunntarmen i en “schweizisk rulle” konfiguration tillsammans med användningen av en fri datorstödd poängsättningssystem för att analysera intestinala slemhinneinflammation och skador på grund av DSS-inducerad kolit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vårt histologiska kolitpoängsystem utgör ett pålitligt verktyg för att kvantifiera vävnadsinflammation och skador i tarmen. Detta tillvägagångssätt ger en förbättrad förståelse för det histopatologiska tillståndet i hela organet utan partiskhet att välja små områden eller ofullständiga avsnitt. Bland de kritiska stegen för att framgångsrikt utföra detta protokoll är korrekt förberedelse av schweiziska rullar som möjliggör analys av minst 90% av tjocktarmens längd; Parallell orientering under pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna stöd från NIH-finansiering DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 och University of Michigan Pathology Slide Scanning Services.
Materials
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. . Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
