En Syngeneic Ortotopisk Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model med amputation til kontrol metastaser sats
Summary
Her beskrives en syngeneisk ortotopisk implantation efterfulgt af en amputationsprocedure af osteosarcoma med spontan lungemetomatase, der kan bruges til præklinisk undersøgelse af metastasebiologi og udvikling af nye terapier.
Abstract
Det seneste fremskridt i behandlingen af osteosarcoma (OS) fandt sted i 1980’erne, hvor multi-agent kemoterapi viste sig at forbedre den samlede overlevelse i forhold til kirurgi alene. For at løse dette problem, formålet med undersøgelsen er at forfine en mindre kendt model af OS i rotter med en omfattende histologi, billeddannelse, biologisk, implantation, og amputation kirurgisk tilgang, der forlænger overlevelse. Vi brugte en immunkompetent, udkonkurreret Sprague-Dawley (SD), syngeneic rotte model med implanteret UMR106 OS celle linje (stammer fra en SD rotte) med ortotopiske tibiale tumor implantater i 3-uger gamle mandlige og kvindelige rotter til model pædiatrisk OS. Vi fandt, at rotter udvikler reproducerbare primære og metastatiske lungetumorer, og at lemmer amputationer på 3 uger efter implantation reducere forekomsten af lungemetaser og forhindre uventede dødsfald. Histologisk, den primære og metastatiske OSs hos rotter var meget lig human OS. Ved hjælp af immunohistochemistry metoder, undersøgelsen viser, at rotte OS er infiltreret med makrofager og T-celler. En proteinekspression undersøgelse af OS celler afslører, at disse tumorer udtrykke ErbB familie kinases. Da disse kinaser også er stærkt udtrykt i de fleste menneskelige OS’er, kan denne rottemodel bruges til at teste ErbB-stihæmmere til terapi.
Introduction
Osteosarcoma (OS) er den mest almindelige primære knogletumor hos børn, unge og unge voksne. Det seneste fremskridt i behandlingen af OS fandt sted i 1980’erne, hvor kemoterapi med flere agenter viste sig at forbedre den samlede overlevelse sammenlignet med kirurgi alene1. OS udvikler sig under hurtig knoglevækst, typisk forekommer i lange rørformede knogler såsom lårben, skinneben, og humerus. De er karakteriseret ved en osteolytisk, osteoblastisk eller blandet udseende med bemærkelsesværdig periosteal reaktion2. Kemoterapi og kirurgisk resektion kan forbedre resultatet for patienter med en 5-årig overlevelse for 65% af patienterne2,3. Desværre, høj kvalitet OS patienter med metastatisk sygdom har 20% overlevelse. OS invaderer regionalt og metastaserer primært til lungerne eller andre knogler og er mere udbredt hos mænd. Det mest overbevisende behov for disse unge patienter er en ny terapi, der forhindrer og eliminerer levedygtigheden af fjerne metastaser.
OS prækliniske modeller er blevet gennemgået4,5,6,7 og få tilgængelige immunkompetente modeller ved hjælp af amputation af orthotopic OS er blevet udviklet. I 2000 blev der udviklet en vigtig model ved hjælp af BALB/c mus med ortotopisk syngeneic OS og amputation8. Sammenlignet med denne musemodel er rottemodellen baseret på genetisk udavlede og 10 gange større dyr, hvilket fører til nogle fordele. Rotten UMR106 model blev udviklet fra en 32P induceret OS i en Sprague Dawley (SD) rotte, som blev afledt i en celle linje9. I 2001 blev ortotopisk implantation af UMR106-01 først beskrevet i implanterede skinneben af athymiske mus med hurtig, konsekvent primær tumorudvikling og radiologiske, histologiske træk til fælles med OS hos mennesker. Lungemetastaser udviklet og var afhængige af ortotopisk placering af UMR106 i knoglen mikromiljø10. I 2009 etablerede Yu et al.11 en reproducerbar ortotopisk lårben OS rotte model ved hjælp af UMR106 celler i større mandlige SD rotter. Den vellykkede tumorimplantatationer og lungemetastaserate hos rotter uden amputation lignede de data, der præsenteres her. I denne undersøgelse, en ekstra amputation til modellen ved hjælp af unge rotter blev udført, hvilket tydede på, at timingen af primære tumor fjernelse er afgørende for modellering OS, især relateret til metastatisk progression. Med denne raffinement forbedrer amputation og in vivo imaging denne model for prækliniske undersøgelser til ny lægemiddelvurdering for OS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rotter med OS tibial implantater udvikle målbare tumorer ved 3 uger efter implantation. Hvis lemmer med tumorer amputeres 3 uger efter implantation, reduceres forekomsten af lungemetastase betydeligt. OS’er er både osteolytiske og osteoblastiske. Rotter uden amputation udvikler lungemetastaser, der er flere og varierende størrelse, observeret ved radiografi eller ved obduktion med 7 uger efter implantation. EGFR, ErbB2 og ErbB4 udtrykkes i rotte UMR106 OS, svarende til human OS16,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH finansiering gennem National Cancer Institute, tilskud # CA228582. Shun Ishiyama modtager i øjeblikket et tilskud fra Toray Medical Co. Ltd.
Materials
| AKT | Cell Signaling TECHNOLOGY | 4685S | |
| absorbable suture | Ethicon | J214H | |
| β-actin | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-47778 | |
| β2-AR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-569 | replaced by β2-AR (E-3): sc-271322 |
| Bis–Tris gels | Thermo Fisher | NP0321PK2 | |
| Buprenorphine SR Lab | ZooPharm | IZ-70000-201908 | |
| CD3 antibody | Dako | #A0452 | |
| CD68 antibody | eBioscience | #14-0688-82 | |
| Chemiluminescent substrate | cytiva | RPN2232 | |
| CL-Xposure film | Thermo Fisher | 34089 | |
| Complete Anesthesia System | EVETEQUIP | 922120 | |
| diaminobenzidine | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Doxorubicin | Actavis | NDC 45963-733-60 | |
| EGFR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-03 | replaced by EGFR (A-10): sc-373746 |
| ERBB2 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-284 | replaced by Neu (3B5): sc-33684 |
| ERBB4 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-283 | replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050 |
| ERK antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-514302 | |
| eye lubricant | PHARMADERM | NDC 0462-0211-38 | |
| Hamilton syringe (100 µL) | Hamilton | Model 1710 SN SYR | |
| horseradish peroxidase-linked secondary antibody | cytiva | NA934 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7401 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7402 | |
| isoflurane | BUTLER SCHEIN | NDC 11695-6776-2 | |
| isoflurane vaporizer | EVETEQUIP | 911103 | |
| UMR-106 cell | ATCC | CRL-1661 | |
| X-ray | Faxitron | UltraFocus | |
| X-ray processor | Hope X-Ray Peoducts Inc | MicroMax X-ray Processor | Hope Processors are not available in USA anymore |
| wound clips | BECTON DICKINSON | 427631 |
References
- Link, M. P., et al. The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity. New England Journal of Medicine. 314 (25), 1600-1606 (1986).
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Botter, S. M., Neri, D., Fuchs, B. Recent advances in osteosarcoma. Current Opinion in Pharmacology. 16, 15-23 (2014).
- Ek, E. T. H., Dass, C. R., Choong, P. F. M. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Guijarro, M. V., Ghivizzani, S. C., Gibbs, C. P. Animal models in osteosarcoma. Frontiers Oncology. 4, 189 (2014).
- Janeway, K. A., Walkley, C. R. Modeling human osteosarcoma in the mouse: From bedside to bench. Bone. 47 (5), 859-865 (2010).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C., Cleton-Jansen, A. M. Osteosarcoma models: from cell lines to zebrafish. Sarcoma. 2012, 417271 (2012).
- Khanna, C., et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clinical & Experimental Metastasis. 18 (3), 261-271 (2000).
- Martin, T. J., et al. Parathyroid hormone-responsive adenylate cyclase in induced transplantable osteogenic rat sarcoma. Nature. 260 (5550), 436-438 (1976).
- Fisher, J. L., Mackie, P. S., Howard, M. L., Zhou, H., Choong, P. F. The expression of the urokinase plasminogen activator system in metastatic murine osteosarcoma: an in vivo mouse model. Clinical Cancer Research. 7 (6), 1654-1660 (2001).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Zhang, P., et al. Homologous mesenchymal stem cells promote the emergence and growth of pulmonary metastases of the rat osteosarcoma cell line UMR-106. Oncology Letters. 8 (1), 127-132 (2014).
- Gabrielson, K., et al. Heat shock protein 90 and ErbB2 in the cardiac response to doxorubicin injury. Cancer Research. 67 (4), 1436-1441 (2007).
- Sysa-Shah, P., et al. Bidirectional cross-regulation between ErbB2 and β-adrenergic signalling pathways. Cardiovascular Research. 109 (3), 358-373 (2016).
- Wachtman, L. M., Browning, M. D., Bedja, D., Pin, S., Gabrielson, K. L. Validation of the use of long-term indwelling jugular catheters in a rat model of cardiotoxicity. Journal of American Association Laboratory Animal Science. 45, 55-64 (2006).
- Abdou, A. G., et al. The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).
- Hughes, D. P., Thomas, D. G., Giordano, T. J., McDonagh, K. T., Baker, L. H. Essential erbB family phosphorylation in osteosarcoma as a target for CI-1033 inhibition. Pediatric Blood & Cancer. 46 (5), 614-623 (2006).
- Wen, Y. H., et al. Epidermal growth factor receptor in osteosarcoma: expression and mutational analysis. Human Pathology. 38 (8), 1184-1191 (2007).
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).
