En Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Modell med amputasjon for å kontrollere metastase rate
Summary
Her beskrives en syngeneisk ortotopisk implantasjon etterfulgt av en amputasjonsprosedyre av osteosarkom med spontan lungemetastase som kan brukes til preklinisk undersøkelse av metastasebiologi og utvikling av nye terapeutiske stoffer.
Abstract
Det siste fremskrittet i behandlingen av osteosarkom (OS) skjedde på 1980-tallet da multi-agent kjemoterapi ble vist å forbedre total overlevelse sammenlignet med kirurgi alene. For å løse dette problemet er målet med studien å avgrense en mindre kjent modell av OS hos rotter med en omfattende histologisk, avbildning, biologisk, implantasjon og amputasjonskirurgisk tilnærming som forlenger overlevelsen. Vi brukte en immunotokmpetent, utbrent Sprague-Dawley (SD), syngeneisk rottemodell med implantert UMR106 OS-cellelinje (som stammer fra en SD-rotte) med ortotopiske tibiale tumorimplantater i 3 uker gamle mannlige og kvinnelige rotter for å modellere pediatrisk OS. Vi fant at rotter utvikler reproduserbare primære og metastatiske lungetumorer, og at lemamputasjoner ved 3 uker etter implantasjon reduserer forekomsten av lungemetastase betydelig og forhindrer uventede dødsfall. Histologisk var de primære og metastatiske OSene hos rotter svært lik humane OS. Ved hjelp av immunhiistokjemimetoder viser studien at rotte os er infiltrert med makrofager og T-celler. En proteinuttrykksundersøkelse av OS-celler avslører at disse svulstene uttrykker ErbB-familiens kinaser. Siden disse kinasene også er sterkt uttrykt i de fleste menneskelige operativsystemer, kan denne rottemodellen brukes til å teste ErbB-banehemmere for terapi.
Introduction
Osteosarkom (OS) er den vanligste primære bensvulsten hos barn, ungdom og unge voksne. Det siste fremskrittet i behandlingen av OS skjedde på 1980-tallet da multi-agent kjemoterapi ble vist å forbedre total overlevelse sammenlignet med kirurgi alene1. OS utvikler seg under rask beinvekst, vanligvis forekommer i lange rørformede bein som lårben, tibia og humerus. De er preget av en osteolytisk, osteoblastisk eller blandet utseende med bemerkelsesverdig periosteal reaksjon2. Kjemoterapi og kirurgisk reseksjon kan forbedre utfallet for pasienter med 5 års overlevelse for 65% av pasientene2,3. Dessverre har høyverdige OS-pasienter med metastatisk sykdom 20% overlevelse. OS invaderer regionalt og metastaserer hovedsakelig til lungene eller andre bein og er mer utbredt hos menn. Det mest overbevisende behovet for disse unge pasientene er en ny terapi som forhindrer og eliminerer levedyktighet av fjerne metastaser.
OS prekliniske modeller har blitt gjennomgått4,5,6,7 og få tilgjengelige immunotokmpente modeller ved hjelp av amputasjon av ortotopisk OS er utviklet. I 2000 ble en viktig modell utviklet ved hjelp av BALB/c mus med ortotopisk syngeneisk OS og amputasjon8. Sammenlignet med denne musemodellen er rottemodellen basert på genetisk utavlet og 10 ganger større dyr som fører til noen fordeler. Rotten UMR106-modellen ble utviklet fra et 32P indusert OS i en Sprague Dawley (SD) rotte, som ble avledet til en cellelinje9. I 2001 ble ortotopisk implantasjon av UMR106-01 først beskrevet i implanterte tibias av athymiske mus med rask, konsistent primær tumorutvikling og radiologiske, histologiske trekk til felles med OS hos mennesker. Lungemetastaser utviklet seg og var avhengige av ortotopisk plassering av UMR106 i beinmikromiljøet10. I 2009 etablerte Yu et al.11 en reproduserbar ortotopisk femur OS-rottemodell ved hjelp av UMR106-celler i større mannlige SD-rotter. De vellykkede tumorimplantasjonene og lungemetastaseraten hos rotter uten amputasjon var lik dataene som presenteres her. I denne studien ble det utført en ekstra amputasjon til modellen ved hjelp av unge rotter, noe som antydet at tidspunktet for primær tumorfjerning er avgjørende for modellering av OS, spesielt relatert til metastatisk progresjon. Med denne raffinement, amputasjon og in vivo imaging forbedre denne modellen for pre-kliniske studier for nye narkotika vurdering for OS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rotter med OS-tibiale implantater utvikler målbare svulster med 3 uker etter implantasjon. Hvis lemmer med svulster amputeres 3 uker etter implantasjon, reduseres forekomsten av lungemetastase betydelig. OSer er både osteolytiske og osteoblastiske. Rotter uten amputasjon utvikler lungemetastaser som er flere og variably størrelse, observert ved radiografi eller ved nekropsi med 7 uker etter implantasjon. EGFR, ErbB2 og ErbB4 uttrykkes i rotte UMR106 OS, lik menneskelig OS16,<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH-midler gjennom National Cancer Institute, stipend # CA228582. Shun Ishiyama mottar for tiden et stipend fra Toray Medical Co., Ltd.
Materials
| AKT | Cell Signaling TECHNOLOGY | 4685S | |
| absorbable suture | Ethicon | J214H | |
| β-actin | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-47778 | |
| β2-AR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-569 | replaced by β2-AR (E-3): sc-271322 |
| Bis–Tris gels | Thermo Fisher | NP0321PK2 | |
| Buprenorphine SR Lab | ZooPharm | IZ-70000-201908 | |
| CD3 antibody | Dako | #A0452 | |
| CD68 antibody | eBioscience | #14-0688-82 | |
| Chemiluminescent substrate | cytiva | RPN2232 | |
| CL-Xposure film | Thermo Fisher | 34089 | |
| Complete Anesthesia System | EVETEQUIP | 922120 | |
| diaminobenzidine | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Doxorubicin | Actavis | NDC 45963-733-60 | |
| EGFR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-03 | replaced by EGFR (A-10): sc-373746 |
| ERBB2 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-284 | replaced by Neu (3B5): sc-33684 |
| ERBB4 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-283 | replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050 |
| ERK antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-514302 | |
| eye lubricant | PHARMADERM | NDC 0462-0211-38 | |
| Hamilton syringe (100 µL) | Hamilton | Model 1710 SN SYR | |
| horseradish peroxidase-linked secondary antibody | cytiva | NA934 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7401 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7402 | |
| isoflurane | BUTLER SCHEIN | NDC 11695-6776-2 | |
| isoflurane vaporizer | EVETEQUIP | 911103 | |
| UMR-106 cell | ATCC | CRL-1661 | |
| X-ray | Faxitron | UltraFocus | |
| X-ray processor | Hope X-Ray Peoducts Inc | MicroMax X-ray Processor | Hope Processors are not available in USA anymore |
| wound clips | BECTON DICKINSON | 427631 |
References
- Link, M. P., et al. The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity. New England Journal of Medicine. 314 (25), 1600-1606 (1986).
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Botter, S. M., Neri, D., Fuchs, B. Recent advances in osteosarcoma. Current Opinion in Pharmacology. 16, 15-23 (2014).
- Ek, E. T. H., Dass, C. R., Choong, P. F. M. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Guijarro, M. V., Ghivizzani, S. C., Gibbs, C. P. Animal models in osteosarcoma. Frontiers Oncology. 4, 189 (2014).
- Janeway, K. A., Walkley, C. R. Modeling human osteosarcoma in the mouse: From bedside to bench. Bone. 47 (5), 859-865 (2010).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C., Cleton-Jansen, A. M. Osteosarcoma models: from cell lines to zebrafish. Sarcoma. 2012, 417271 (2012).
- Khanna, C., et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clinical & Experimental Metastasis. 18 (3), 261-271 (2000).
- Martin, T. J., et al. Parathyroid hormone-responsive adenylate cyclase in induced transplantable osteogenic rat sarcoma. Nature. 260 (5550), 436-438 (1976).
- Fisher, J. L., Mackie, P. S., Howard, M. L., Zhou, H., Choong, P. F. The expression of the urokinase plasminogen activator system in metastatic murine osteosarcoma: an in vivo mouse model. Clinical Cancer Research. 7 (6), 1654-1660 (2001).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Zhang, P., et al. Homologous mesenchymal stem cells promote the emergence and growth of pulmonary metastases of the rat osteosarcoma cell line UMR-106. Oncology Letters. 8 (1), 127-132 (2014).
- Gabrielson, K., et al. Heat shock protein 90 and ErbB2 in the cardiac response to doxorubicin injury. Cancer Research. 67 (4), 1436-1441 (2007).
- Sysa-Shah, P., et al. Bidirectional cross-regulation between ErbB2 and β-adrenergic signalling pathways. Cardiovascular Research. 109 (3), 358-373 (2016).
- Wachtman, L. M., Browning, M. D., Bedja, D., Pin, S., Gabrielson, K. L. Validation of the use of long-term indwelling jugular catheters in a rat model of cardiotoxicity. Journal of American Association Laboratory Animal Science. 45, 55-64 (2006).
- Abdou, A. G., et al. The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).
- Hughes, D. P., Thomas, D. G., Giordano, T. J., McDonagh, K. T., Baker, L. H. Essential erbB family phosphorylation in osteosarcoma as a target for CI-1033 inhibition. Pediatric Blood & Cancer. 46 (5), 614-623 (2006).
- Wen, Y. H., et al. Epidermal growth factor receptor in osteosarcoma: expression and mutational analysis. Human Pathology. 38 (8), 1184-1191 (2007).
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).
