इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य ड्रोसोफिला अंडाशय में उपकोशिकीय संरचनाओं के स्थानीयकरण और गतिशीलता पर ऑक्सीडेटिव क्षति के प्रभावों की कल्पना करने के लिए लाइव इमेजिंग का उपयोग करना है।
ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर अंडाशय की लाइव इमेजिंग विकास के दौरान विभिन्न बुनियादी सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, जिसमें रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन कण आंदोलन, एमआरएनए स्थानीयकरण, ऑर्गेनेल आंदोलन और साइटोस्केलेल गतिशीलता शामिल हैं। लाइव इमेजिंग के लिए कई तरीके हैं जिन्हें विकसित किया गया है। इस तथ्य के कारण कि प्रत्येक विधि में मीडिया या हेलोकार्बन तेल में रखे गए व्यक्तिगत अंडाशय को विच्छेदन करना शामिल है, हाइपोक्सिया के कारण सेलुलर क्षति और/या शारीरिक हेरफेर अनिवार्य रूप से समय के साथ हो जाएगा । हाइपोक्सिया का एक डाउनस्ट्रीम प्रभाव कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव क्षति को बढ़ाना है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य नियंत्रित सेलुलर क्षति के प्रेरण के बाद ड्रोसोफिला अंडाशय में उपकोशिकीय संरचनाओं के स्थानीयकरण और गतिशीलता पर ऑक्सीडेटिव क्षति के प्रभावों की कल्पना करने के लिए लाइव इमेजिंग का उपयोग करना है। यहां, हम सेलुलर ऑक्सीडेटिव क्षति को प्रेरित करने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग करते हैं और दो उपकोशिकीय संरचनाओं, माइटोकॉन्ड्रिया और सीएलयू आनंद कणों पर इस तरह के नुकसान के प्रभावों का उदाहरण देते हैं। हालांकि, यह विधि किसी भी उपकोशिकीय संरचना पर लागू होती है। सीमाएं हैं कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड को केवल जलीय मीडिया में जोड़ा जा सकता है और वेलोकार्बन तेल का उपयोग करने वाले इमेजिंग के लिए काम नहीं करेगा। फायदे यह हैं कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड आसानी से उपलब्ध है और सस्ती है, जल्दी से कार्य करता है, इसकी सांद्रता को संग्राहक किया जा सकता है, और ऑक्सीडेटिव क्षति हाइपोक्सिया के साथ-साथ हेरफेर के कारण सामान्य ऊतक क्षति के कारण होने वाले नुकसान का एक अच्छा सन्निकटन है।
कई अलग-अलग सेलुलर तनाव प्रयोगात्मक संस्कृति और ऊतकों के हेरफेर के दौरान उत्पन्न हो सकते हैं, जिनमें गर्मी का झटका, ऑक्सीडेटिव तनाव, ऑस्मोटिक तनाव, पोषण तनाव और विषाक्तता की स्थिति शामिल है। लाइव इमेजिंग एक शक्तिशाली उपकरण है जो प्रयोगात्मक उपचार और हेरफेर के बाद पूर्व वीवो ऊतकों में वास्तविक समय में परिवर्तन की कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है। ठीक ऊतक विच्छेदन और हेरफेर अभ्यास लेते हैं, और विच्छेदन से इमेजिंग तक समय की मात्रा अनुभव के आधार पर भिन्न हो सकती है। इस विधि को विकसित करने का औचित्य इस चिंता पर आधारित है कि लाइव इमेजिंग के लिए ऊतक तैयार करने से विच्छेदन और इमेजिंग तैयारी के दौरान सेलुलर तनाव हो सकता है। यह सेलुलर मेटाबोलिज्म और उपलब्ध ऑक्सीजन स्तर, जैसे माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील प्रक्रियाओं के लिए विशेष रूप से समस्याग्रस्त हो सकता है। जबकि एक समानांतर जंगली प्रकार का नमूना होना एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है, अभी भी संभावना है कि उपकोशिकीय संरचनाओं में कुछ या सभी देखे गए परिवर्तन विच्छेदन से नुकसान या सेल तनाव के कारण हो सकते हैं और सामान्य शरीर विज्ञान या उपचार या उत्परिवर्तन का अध्ययन नहीं करते हैं।
इस संभावित समस्या का समाधान करने के लिए, हम सेलुलर ऑक्सीडेटिव क्षति को प्रेरित करने के लिए लाइव इमेजिंग के दौरान हाइड्रोजन पेरोक्साइड अतिरिक्त का उपयोग करते हैं1। इस विधि का उद्देश्य उपकोशिकीय संरचनाओं पर प्रभाव की निगरानी करने के लिए ऊतकों को नुकसान पहुंचाना है। यह प्रोटोकॉल दो उद्देश्यों के लिए उपयोगी है: 1) यह निर्धारित करना कि क्या ब्याज की संरचना के उपकोशिकीय स्थानीयकरण में परिवर्तन अनुभवहीन विच्छेदन और 2 के कारण होने वाले तनाव के कारण होता है) एक बार शोधकर्ता ब्याज की संरचना पर नियंत्रित तनाव के प्रभाव की निगरानी के लिए वर्णित विच्छेदन तकनीकों के साथ आश्वस्त है। यहां हम दो उदाहरण दिखाते हैं कि कैसे बढ़ी हुई ऑक्सीडेटिव क्षति दो उपकोशिकीय संरचनाओं, माइटोकॉन्ड्रिया और सीएलयू आनंद कणों में परिवर्तन का कारण बनती है। ऐसा करने के लिए, हम ड्रोसोफिला अंडाशय का उपयोग करते हैं जो लाइव इमेजिंग अध्ययन के लिए एक आम मॉडल है। पहला उदाहरण माइटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकरण की जांच करता है। हमारे अनुभव में, महिला रोगाणु कोशिकाओं में सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकरण क्षोभ के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है और सेलुलर तनाव के अग्रदूत के रूप में कार्य कर सकता है। ड्रोसोफिला मादा रोगाणु कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया सामान्य रूप से साइटोप्लाज्म 2 में समान रूप से फैलायाजाताहै। हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अलावा ऑर्गेनेल्स को विभिन्न म्यूटेशन 3 ,4,5के समान तरीके से जल्दी से गलत और क्लस्टर करने का कारणबनताहै । दूसरा उदाहरण अनजान (सीएलयू) द्वारा गठित आनंद कण हैं। सीएलयू एक राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन है जो पूरे साइटोप्लाज्म में फैलाना है; हालांकि, यह इष्टतम सेलुलर स्थितियों5के तहत माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़े कण भी बनाता है । क्योंकि सीएलयू कणों की उपस्थिति स्वस्थ सेलुलर स्थितियों पर निर्भर है, हमने उन्हें “आनंद”कणों को 3,5,6करार दिया है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अलावा इन कणों को जल्दी से तितर – बितर करने और साइटोप्लाज्म5में सजातीय हो जाता है । हमारे अध्ययनों के दौरान, हमने इन दोनों उपकोशिकीय संरचनाओं के स्थानीयकरण में परिवर्तन देखा है, लेकिन लाइव इमेजिंग अध्ययन करने के बाद ही हम माइटोकॉन्ड्रिया और आनंद कणों के स्थानीयकरण और गतिशीलता पर सेलुलर तनाव और ऑक्सीडेटिव क्षति के प्रभाव की पूरी तरह से सराहना कर सकते हैं।
पहले से ही स्थापित या वैकल्पिक तरीकों के अलावा के रूप में इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता कई कारकों पर निर्भर करती है। सबसे पहले, इमेजिंग प्रोटोकॉल दवा के अलावा करने के लिए उत्तरदायी होना चाहिए । यदि नमूना एक कवरस्लिप के तहत और हेलोकार्बन तेल में रखा जाता है, तो यह विधि संभव नहीं होगी7। एच2ओ2 इसके अलावा ऑक्सीडेटिव डैमेज में तेजी से बढ़ोतरी होती है, इसलिए यह टाइमस्केल उचित नहीं हो सकता है। ऑक्सीडेटिव क्षति को हाइपोक्सिया के लिए प्रॉक्सी माना जा सकता है; हालांकि, कुछ उपकोशिकीय घटकों के लिए क्षति के लिए उचित नियंत्रण के रूप में कार्य करना बहुत कठोर या बहुत सामान्यीकृत हो सकता है। अंत में, इमेजिंग प्रयोगों के लिए जो पिछले घंटों जैसे कि विकास प्रक्रिया का पालन करने वाले, एच2ओ2 अतिरिक्त बहुत मजबूत हो सकते हैं (उदाहरण के लिए8)। एकाग्रता वक्र का परीक्षण इस सीमा को दूर कर सकता है।
यह प्रोटोकॉल किसी भी लाइव इमेजिंग प्रयोग के लिए अंडाशय विच्छेदन और ऊतक इनक्यूबेशन के कारण कलाकृतियों के लिए एक नियंत्रण के रूप में एक उपयोगी अतिरिक्त हो सकता है। महत्वपूर्ण कदम अन्य लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल के लिए पाए जाने वाले लोगों के समान हैं। सीखना कैसे पूरे ड्रोसोफिला अंडाशय विच्छेदन करने के लिए अभ्यास लेता है; हालांकि, इस कौशल को आमतौर पर उचित विच्छेदन उपकरणों के साथ काफी जल्दी सीखा जा सकता है। अधिक मुश्किल में महारत हासिल करने के लिए मांसपेशियों अंडाशय और प्रत्येक ovariole13घेर हटा रहा है । यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि मांसपेशियों के संकुचन छवि अधिग्रहण में हस्तक्षेप न करें। यदि ऐसा करने के लिए तेज टंगस्टन सुइयों का उपयोग सफल साबित नहीं होता है, तो ओवेरियोल की नोक पर जर्मेरियम को संदंश के साथ समझा जा सकता है और मांसपेशियों के म्यान से ओवेरोल खींचा जा सकता है। हालांकि, यह तकनीक समस्याग्रस्त है यदि शुरुआती विकास चरणों की जांच की जानी है क्योंकि वे क्षतिग्रस्त हो सकते हैं। एक अन्य महत्वपूर्ण कदम यह है कि एच 2 ओ2को जोड़ते समय डिश के तल पर आराम करने वाले ओवियोल्स को उखाड़ नफेंकाजाए । एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण पहलू सभी लाइव इमेजिंग द्वारा साझा किया जाता है: शोधकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि ब्याज की संरचना इलाज से पहले फ्लोरोसेंटली रूप से अच्छी तरह से लेबल की गई है। यहां उपयोग किए जाने वाले व्यंजन(सामग्री की तालिका)आमतौर पर लाइव इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाते हैं; हालांकि, नीचे या यहां तक कि एक बड़े ग्लास कवरस्लिप पर ग्लास कवरलिप के साथ कोई भी पकवान या स्लाइड तब तक काम करना चाहिए जब तक मीडिया की बूंद को मीडिया वाष्पीकरण को रोकने के लिए कवर किया जा सकता है। जबकि हम एक विशेष माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं, प्रश्न में उपकोशिकीय संरचना को देखने के लिए पर्याप्त आवर्धन के उद्देश्य के साथ किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप और एक संलग्न कैमरा जिसमें पर्याप्त संकल्प और छवि कैप्चर दर है, काम करना चाहिए।
जबकि हमारी प्रयोगशाला मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में रुचि रखती है, यह विधि किसी भी उपकोशिक संरचना या ऑर्गेनेल की गतिशीलता और स्थानीयकरण की जांच करने में सहायक हो सकती है, जैसे नाभिक, साइटोस्केलेटन या एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम। हालांकि, इस विधि की सीमाएं हैं। हाइड्रोजन पेरोक्साइड जोड़ने के लिए, ऊतक एक जलीय मीडिया में होना चाहिए। लाइव इमेजिंग के लिए एक वैकल्पिक विधि हेलोकार्बन तेल का उपयोग करना है, जो ड्रोसोफिला ओवरियोल्स में कई महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं का वर्णन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता रहा है जिसमें एक मॉडल जीव7,14में जीएफपी के गतिशील आंदोलन का पहला उदाहरण शामिल है। इसके अलावा, मीडिया में हाइड्रोजन पेरोक्साइड जोड़ने से व्यापक रूप से फैलने वाले ऑक्सीडेटिव क्षति का कारण बनता है जो ऊतक के लिए एक अपमान भी सामान्य हो सकता है ब्याज की सेलुलर प्रक्रिया के लिए जानकारीपूर्ण हो, विशेष रूप से विकास की जांच करने वाले लंबे प्रयोगों के लिए। हालांकि यह प्रयोग है जो इस तेजी से, व्यापक, और संभावना अपरिवर्तनीय ऑक्सीडेटिव क्षति के कारण समय की लंबी अवधि में सेल कल्पना की आवश्यकता प्रदर्शन करने के लिए संभव नहीं हो सकता है, हमने देखा है कि तीव्र हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार हमने वर्णित है oogenesis के अधिकांश चरणों के लिए लागू है के रूप में हम इमेजिंग समय अवधि के भीतर अधिकांश चरणों में एक ही प्रभाव देखने में सक्षम हैं । कम लागत और प्रोटोकॉल की आसानी को देखते हुए, यह नुकसान के लिए एक उपयोगी नियंत्रण हो सकता है और निर्धारण और एंटीबॉडी लेबलिंग से पहले एक उपचार के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
हमारे हाथों में, एच2ओ2 उपचार माइटोकॉन्ड्रियल मिसमोकलाइजेशन और सीएलयू आनंद कण फैलाव में परिवर्तनों की नकल करता है जिसे हम विभिन्न ड्रोसोफिला म्यूटेंट में देखते हैं। यह भी परिणाम हम प्रयोगशाला सीखने विच्छेदन तकनीकों में नए शोधकर्ताओं के लिए देखने की नकल करता है । इसलिए, इस विधि से स्पष्ट रूप से पता चला है कि नमूना तैयारी और सामान्य सेलुलर तनाव माइटोकॉन्ड्रियल मिसमोकलाइजेशन और आनंद कणों की उपस्थिति में अप्रत्याशित और पहले अस्पष्टीकृत परिवर्तन का कारण बन सकता है। इस तकनीक को आगे बढ़ाते हुए, हाइड्रोजन पेरोक्साइड सांद्रता को उच्च या कम एकाग्रता का उपयोग करके संग्राहक किया जा सकता है। यदि एक सेलुलर प्रभाव कम एकाग्रता का उपयोग करते हुए देखा जाता है, तो यह संभव है कि मीडिया को पूर्ण श्नाइडर के साथ बदलकर तनाव फेनोटाइप प्रतिवर्ती हो सकता है। कार्बोनाइल सायनाइड एम-क्लोरोफेनिल हाइड्राजोन (सीसीसीपी), आर्सेनाइट या साधारण हीट शॉक जैसे विभिन्न सेल तनाव अन्य उपकोशिकीय संरचनाओं के लिए सामान्य सेलुलर तनाव के लिए उपयोगी साबित हो सकते हैं। चूंकि पूर्व वीवो ऊतकों की लाइव इमेजिंग के लिए विभिन्न मीडिया में मैन्युअल हेरफेर और इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है, इसलिए यह नियंत्रण यह सुनिश्चित करने के लिए एक उपयोगी अतिरिक्त होना चाहिए कि कोई भी अवलोकन संभव के रूप में सामान्य शरीर विज्ञान के करीब हो।
The authors have nothing to disclose.
हम इमेजिंग समर्थन और एन सी शेंक के लिए चित्र, उत्पादन और वीडियोग्राफी के लिए डॉ जेरेमी Smyth शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (1R01GM127938 से आर टी.C) द्वारा समर्थित किया गया था।
Active dry yeast | Red Star® | ||
CO2 gas | 99.9% purity | ||
CO2 pad | |||
Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
Dissecting needles – PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
Dissecting needles – PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
Dissecting needles – tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |