यह प्रोटोकॉल स्नैप जमे हुए ऊतकों से क्रोमैटिन तैयारी पर केंद्रित है और यह क्रॉसलिंकिंग क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन (एक्स-सीएचआईपी) के लिए उपयुक्त है, जिसके बाद मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण (एक्स-सीएचआईपी-क्यूपीसीआर) या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण (एक्स-सीएचआईपी-सेक) हैं।
क्रॉसलिंकिंग क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन (एक्स-सीएचआईपी) एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है जो मेजबान और / या रोगज़नक़ क्रोमैटिन पर हिस्टोन निशान और प्रतिलेखन कारकों के अधिभोग के स्तर का आकलन करती है। ऊतकों से क्रोमैटिन की तैयारी अतिरिक्त चुनौतियां पैदा करती है जिन्हें सेल संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्राप्त करने के लिए दूर करने की आवश्यकता होती है। क्रोमैटिन के कुशल कतरन को प्राप्त करने के लिए ऊतक विघटन और निर्धारण महत्वपूर्ण कदम हैं। विभिन्न सेल प्रकारों और समूहों के सह-अस्तित्व को इष्टतम टुकड़े के आकार तक पहुंचने के लिए अलग-अलग कतरनी समय की आवश्यकता हो सकती है और कतरनी प्रजनन क्षमता में बाधा उत्पन्न होती है। इस विधि का उद्देश्य सीएचआईपी-क्यूपीसीआर और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) दोनों अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त जमे हुए ऊतक (यकृत) से विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मेजबान क्रोमैटिन तैयारी प्राप्त करना है। हमने देखा कि होमोजेनाइजेशन के बाद तरल नाइट्रोजन ऊतक पुल्वराइजेशन के संयोजन से केवल होमोजेनाइजेशन की तुलना में प्रजनन क्षमता में वृद्धि होती है, क्योंकि यह एक निलंबन प्रदान करता है जिसमें ज्यादातर विघटित एकल कोशिकाएं होती हैं जिन्हें कुशलतापूर्वक कतरनी किया जा सकता है। इसके अलावा, सजातीय क्रॉसलिंकिंग प्रदान करने के लिए निर्धारण चरण हल्के रोटेशन के तहत किया जाना चाहिए। निश्चित सामग्री तब बफर-आधारित नाभिक अलगाव के लिए उपयुक्त है, ताकि साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन और रोगज़नक़ डीएनए और आरएनए (जब लागू हो) के संदूषण को कम किया जा सके, समय लेने वाले सेंट्रीफ्यूजेशन ग्रेडिएंट से बचा जा सके। बाद में सोनिकेशन परमाणु लाइसिस को पूरा करेगा और क्रोमैटिन को कतरनी देगा, जो चुने हुए कतरन स्थितियों के अनुसार एक विशिष्ट आकार सीमा का उत्पादन करेगा। एनजीएस अनुप्रयोगों के लिए आकार सीमा 100 और 300 एनटी के बीच होनी चाहिए, जबकि यह सीएचआईपी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए अधिक (300-700 एनटी) हो सकती है। इस तरह के प्रोटोकॉल अनुकूलन जमे हुए ऊतक नमूनों से क्रोमैटिन विश्लेषण में काफी सुधार कर सकते हैं।
इसकी खोज के बाद से, स्तनधारी कोशिकाओं में एपिजेनेटिक विनियमन ने बढ़ती मान्यता प्राप्त कीहै 1, यह देखते हुए कि इस तरह के तंत्र की समझ न केवल कोशिका जीव विज्ञान में, बल्कि रोग और ट्यूमर जीव विज्ञान में भी महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी। इसके अलावा, संक्रामक एजेंट मेजबान एपिजेनेटिकपरिवर्तन 2 का कारण भी बन सकते हैं जबकि मेजबान सेल मशीनरी रोगजनकों के क्रोमैटिन को भी प्रभावित कर सकती है, जैसे कि डीएनए वायरस 3,4। यह मेजबान-रोगज़नक़ परस्पर क्रिया संक्रमण दृढ़ता में एक भूमिका निभाती है। 2
डीएनए के साथ एक प्रतिवर्ती संबंध के माध्यम से, हिस्टोन प्रोटीन न्यूक्लियोसोम नामक एक परिसर बनाते हैं। न्यूक्लियोसोम बदले में क्रोमैटिन नामक संगठन के एक उच्च स्तर तक पहुंचते हैं। क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग जीन अभिव्यक्ति को कसकर विनियमित करने, प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) तक पहुंच प्रदान करने या अस्वीकार करने के लिए जाना जाता है। ये कारक या तो जीन प्रमोटरों पर आरएनए पोलीमरेज़ II (पीओएलआईआई) की भर्ती को ट्रिगर या अवरुद्ध कर सकते हैं, डीएनए टेम्पलेट6 से एमआरएनए संश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं। हिस्टोन प्रोटीन में पूंछ7 होते हैं, जो हिस्टोन फोल्ड के दोनों सिरों को फ्लैंक करते हैं, जो पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) के अधीन हो सकते हैं, जिससे संरचनात्मक क्रोमैटिन परिवर्तनों द्वारा जीन प्रतिलेखन के तंग विनियमन की अनुमति मिलती है। अधिकांश हिस्टोन पीटीएम पूंछ एन-टर्मिनस पर स्थित हैं, जिसमें एसिटिलीकरण और मिथाइलेशन सबसे अच्छा अध्ययन किए गए पीटीएम हैं, हालांकि फॉस्फोराइलेशन8, सर्वव्यापी9 और राइबोसिलेशन10 भी रिपोर्ट किए गए हैं। जीन विनियमन में गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए ऐसे प्रोटीन ों की विशेषता और अध्ययन करना आवश्यक है।
वर्तमान में, प्रत्यक्ष डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए कुछ अच्छी तरह से स्थापित तरीके और उपकरण उपलब्ध हैं: इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटी शिफ्ट परख (ईएमएसए), खमीर एक-हाइब्रिड परख (वाई 1 एच) और डीएनए फुटप्रिंटिंग11। हालांकि, ये विधियां एकल डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन पर ध्यान केंद्रित करती हैं और जीनोम-व्यापक अध्ययन के लिए लागू नहीं होती हैं। उन तकनीकों की एक और सीमा डीएनए खंडों की जांच के साथ हिस्टोन एसोसिएशन की कमी है। इस प्रकार, इस तरह के दृष्टिकोण विवो में ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी की जटिलता को प्रतिबिंबित करने के लिए नहीं हैं और वे महत्वपूर्ण संरचनात्मक परिवर्तनों12 या अन्य आवश्यक एंजाइमों / कोफ़ैक्टर्स13 को ध्यान में नहीं रखते हैं जो डीएनए को प्रोटीन बाइंडिंग को प्रभावित (या तो बढ़ावा दे सकते हैं या बाधित कर सकते हैं)।
यह विचार कि फॉर्मलाडेहाइड (एफए) जैसे एजेंटों के साथ कोशिकाओं को ठीक करना प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन का एक इनविवो स्नैपशॉट प्रदान कर सकता है, ने क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिटेशन एसेस (सीएचआईपी) 14 के विकास के लिए आधार बनाया। यह, मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) तकनीक और अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी की उपलब्धता के साथ, सीएचआईपी-क्यूपीसीआर परख के विकास की अनुमति देता है। इसके बाद, अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकों (एनजीएस) के आगमन, जिनकी लागत अधिक किफायती हो रही है, ने एनजीएस दृष्टिकोण (सीएचआईपी-सेक) के साथ कुछ सीएचआईपी प्रयोगों को स्वीकार किया, इस प्रकार शोधकर्ताओं को क्रोमैटिन विनियमन की जांच को सक्षम करने वाले नए शक्तिशाली उपकरण प्रदान किए। इन परखों में, पृथक या सुसंस्कृत कोशिकाओं को डिसुसिनिमिडिल ग्लूटारेट (डीएसजी) और / या एफए के साथ तय किया जाता है, नाभिक को अलग किया जाता है, क्रोमैटिन को तब खंडित किया जाता है और रुचि के एंटीबॉडी द्वारा अवक्षेपित किया जाता है। इसके बाद, पीसीआर या एनजीएस दृष्टिकोण द्वारा डीएनए को शुद्ध और विश्लेषण किया जाता है। ईएमएसए, वाई 1 एच और डीएनए पदचिह्न के विपरीत, सीएचआईपी परख में सेल के भीतर प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन का वैश्विक स्नैपशॉट प्रदान करने की क्षमता है। यह लचीलापन प्रदान करता है और एक ही नमूने के भीतर कई लोकी के विश्लेषण की अनुमति देता है। हालांकि, परख की प्रकृति के कारण, सीएचआईपी, अंततः, न केवल प्रत्यक्ष इंटरैक्शन का पता लगा सकता है, बल्कि अप्रत्यक्ष भी हो सकता है, जब प्रत्यक्ष प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन में रुचि रखते हैं, तो उपर्युक्त विधियों की सटीकता की पेशकश नहीं करते हैं।
सेल कल्चर सामग्री से क्रोमैटिन तैयारी प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित15 और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, जिससे उपयोगकर्ता को 1-2 कार्य दिवसों में क्यूपीसीआर और एनजीएस दोनों दृष्टिकोणों के लिए उपयुक्त क्रोमैटिन प्राप्त करने की अनुमति मिलती है। हालांकि, पूरे ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले क्रोमैटिन प्राप्त करना अभी भी एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि क्रोमैटिन के इष्टतम निर्धारण और कतरनी को प्राप्त करते हुए ऊतक के भीतर कोशिकाओं को अलग करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, अलग-अलग प्रकार के ऊतकों की संरचना और आकृति विज्ञान भिन्न होते हैं, इस प्रकार मौजूदा प्रोटोकॉल16,17 के समायोजन की आवश्यकता होती है। क्रायोसंरक्षित ऊतक का उपयोग ताजा नमूनों की तुलना में अतिरिक्त चुनौतियां प्रदान करता है। यह व्यापक सामग्री हानि के बिना एकल सेल निलंबन प्राप्त करने की कठिनाई के कारण है। इससे अनुचित कतरनी होती है, डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में बाधा आती है। बहरहाल, ताजा समकक्ष के बजाय जमे हुए ऊतक नमूनों तक पहुंचने से न केवल काम का लचीलापन बढ़ता है, बल्कि यह अनुदैर्ध्य या तुलनात्मक अध्ययन से उत्पन्न नमूनों के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं के लिए एकमात्र विकल्प का भी प्रतिनिधित्व कर सकता है। जमे हुए ऊतक के लिए मुट्ठी भर क्रोमैटिन तैयारी प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं। ये ज्यादातर नमूना पिघलने पर आधारित होते हैं, जिसके बाद मिनिंग, मैनुअल / मशीन-आधारित पृथक्करण या तरल नाइट्रोजन पुल्वराइजेशन चरण18,19,20 होते हैं।
यहां हम जमे हुए अनिर्धारित यकृत नमूनों के लिए एक अनुकूलित क्रोमैटिन तैयारी विधि15 का वर्णन करते हैं, जो वायरल और मेजबान जीनोम दोनों का विश्लेषण करने के उद्देश्य से एक्स-सीएचआईपी दृष्टिकोण ों के लिए उपयुक्त प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य क्रोमैटिन कतरनी प्राप्त करने के लिए तरल नाइट्रोजन में ऊतक पुल्वराइजेशन को पेस्टल होमोजेनाइजेशन के साथ जोड़ता है।
स्नैप जमे हुए ऊतक से क्रोमैटिन की तैयारी एक चुनौती बनी हुई है क्योंकि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए कई चरणों को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। पहले से ही प्रकाशित प्रोटोकॉल16,23 में से अधिकांश को मैनुअल पृथक्करण (डौंसिंग) से पहले ऊतक मिंकिंग की आवश्यकता होती है। हमने उन कदमों से बचने की कोशिश की जो जितना संभव हो सके नमूने के निर्धारण से पहले प्रोटीन क्षरण को भड़का सकते हैं। फुफ्फुसीकरण चरण पहले से ही जमे हुए यकृतकी तैयारी 24 में उपयोग किया जाता है और मैन्युअल पृथक्करण को आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाता है (चित्रा 2 ए देखें)। विशेष रूप से 1.5 एमएल ट्यूबों (प्रोटोकॉल देखें) के लिए डिज़ाइन किए गए मोर्टार के उपयोग के साथ, फुफ्फुसप्रक्रिया के दौरान नमूना हानि कम हो जाती है, जिससे यकृत बायोप्सी नमूने जैसे ऊतक की छोटी मात्रा को संसाधित करने की अनुमति मिलती है। सिद्धांत रूप में किसी भी पीसने के चरणों के बिना प्रत्यक्ष ऊतक समरूपीकरण का उपयोग करना संभव है; हालांकि, पिछले पुल्वराइजेशन के बिना ऊतक समरूपीकरण में हमारे अनुभव में एक खराब प्रजनन क्षमता है और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए समस्याओं की उपस्थिति अधिक थी (डेटा नहीं दिखाया गया है)।
ऊतकों से क्रोमैटिन तैयार करने में आने वाली अधिकांश समस्याएं इन नमूनों की प्रकृति और ठीक से जांचने की अक्षमता से उत्पन्न होती हैं कि क्या सेल क्लस्टर गुणवत्ता खोए बिना निर्धारण के लिए पर्याप्त छोटे हैं। इसके अलावा, प्रत्येक चरण में प्रत्येक एलिकोट की जांच करने में समय लगेगा जिससे प्रोटीन क्षरण की संभावना बढ़ जाएगी।
निर्धारण (चरण 3.9) क्रोमैटिन तैयारी का एक मौलिक और महत्वपूर्ण हिस्सा है। ऊतक की प्रकृति के कारण, निर्धारण चरण में देरी हुई है जब तक कि ऊतक को समरूप नहीं किया गया था। इस तरह के स्थगित निर्धारण चरण में अधिक सजातीय सेल निलंबन का उत्पादन करने का लाभ है। हालांकि, हम मानते हैं, कि विशेष रूप से हेरफेर-संवेदनशील लक्ष्यों के मामले में, चरण 3.6 से ठीक पहले निर्धारण करना आवश्यक हो सकता है। यह बेहद संवेदनशील प्रोटीन या पीटीएम की रक्षा करने में मदद करेगा, हालांकि यह सेल क्लस्टर के आकार को बढ़ा सकता है, जो तय होने पर गैर-सजातीय कतरनी का परिणाम हो सकता है। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एफए समाधान की एकाग्रता मानक है, हालांकि, इसे समग्र निर्धारण में सुधार करने का प्रयास करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। यहां चुना गया निर्धारण समय आमतौर पर क्षेत्र में उपयोग की जाने वाली मानक स्थितियों को भी दर्शाता है। फिक्सिंग समाधान की उच्च सांद्रता के मामले में, निर्धारण समय कम हो सकता है, जबकि कम राशि के मामले में इसे बढ़ाया जाना चाहिए। ऑपरेटर को यह विचार करना चाहिए कि निर्धारण समय में बदलाव से या तो नमूने का अति-निर्धारण हो सकता है या प्रोटीन क्षरण के लिए जगह मिल सकती है। बड़े परिसरों (या इसके हिस्से) और टीएफ को अवक्षेपित करने के लक्ष्य के मामले में, डीएसजी समाधान का उपयोग करके डबल स्टेप निर्धारण करना फायदेमंद होगा, जिसके बाद एफए25,26 होगा। इस मामले में डीएसजी प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को स्थिर करेगा, जबकि फॉर्मलाडेहाइड ज्यादातर प्रत्यक्ष डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन27 पर कार्य करता है।
ऑपरेटर को चरण 6.7 से शुरू होने वाले डीएनए शुद्धिकरण के लिए एक कॉलम-आधारित किट को लागू करने की संभावना को ध्यान में रखना चाहिए जो तेज है और विषाक्त यौगिकों का उपयोग नहीं करता है। हालांकि, हमेशा अनबाउंड डीएनए की एक निश्चित मात्रा होगी जो खो जाएगी। इस कारण से, हम ईटीओएच वर्षा के बाद शास्त्रीय फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। इसके अलावा, एगारोस जेल (चरण 7.2) चलाने से पहले डीएनए एकाग्रता को मापना और स्पष्ट तस्वीर रखने के लिए हर कुएं के लिए समान मात्रा में लोड करना फायदेमंद हो सकता है।
इस प्रोटोकॉल की एक सीमा इस तथ्य से उपजी है कि हमने इस प्रोटोकॉल का पता लगाया और उपयोग केवल मानव-यकृत चिमेरिक चूहोंसे प्राप्त यकृत नमूनों का उपयोग करके किया। प्रति यकृत में उपकला और संयोजी ऊतकहोते हैं। रोग के मामले में, फाइब्रोटिक ऊतक और वसा ऊतक30,31 मौजूद हो सकते हैं जो ऊतक व्यवधान के दौरान अतिरिक्त चुनौतियां पैदा करते हैं। हालांकि, हम मानते हैं कि हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग हड्डी, मांसपेशियों और वसा ऊतक पर पृथक्करण और सोनिकेशन चरणों के अनुकूलन के बिना नहीं किया जा सकता है। ध्यान देने योग्य बात यह है कि प्रत्येक ऊतक को सेल कल्चर नमूने15 की तरह उन सभी के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल की अनुपस्थिति के कारण किसी प्रकार के अनुकूलन की आवश्यकता होती है। हालांकि, हमारा मानना है कि बहुत कम या बिना किसी अनुकूलन के, इस प्रोटोकॉल को अन्य ऊतकों पर सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है जो संरचना में यकृत के साथ समानताएं साझा करते हैं, जैसे फेफड़े, आंत, पेट, अग्न्याशय या गुर्दे के ऊतक।
हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग एचबीवी सहसंयोजक बंद डीएनए एपिसोम (सीसीसीडीएनए) 32 पर टीएफ और हिस्टोन संशोधनों का विश्लेषण करने के लिए भी सफलतापूर्वक किया गया है। यह यकृत को प्रभावित करने वाले अन्य वायरल जीनोम जैसे मानव साइटोमेगालोवायरस33 (एचएमवी) और मानव एडेनोवायरस34 (एचएडीवी) के लिए इस तरह के दृष्टिकोण को लागू करने का मौका खोलता है। यह बाहर नहीं किया गया है कि अन्य डीएनए वायरस का विश्लेषण करना संभव होगा जो अन्य ऊतकों जैसे कपोसी सारकोमा हर्पीस वायरस35 (केएचएसवी), हर्पीस सिम्प्लेक्स वायरस 36 (एचएसवी 1/2) पॉलीओमा वायरस, एपस्टीन-बार वायरस37 (ईबीवी) में लगातार संक्रमण स्थापित करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
अध्ययन को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) द्वारा मौरा डांड्री (एसएफबी 841 ए 5) और हैम्बर्ग राज्य द्वारा अनुसंधान कार्यक्रम (एलएफएफ-एफवी 44: ईपीआईएलओजी) के साथ अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
हम तकनीकी सहायता के लिए और पांडुलिपि को गंभीर रूप से पढ़ने के लिए डॉ टैसिलो वोल्ज़, यवोन लाडिग्स और अन्निका वोल्मारी को धन्यवाद देना चाहते हैं। थॉमस गुंथर और प्रोफेसर एडम ग्रुंडहॉफ ने सीएचआईपी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए बहुत उपयोगी सुझाव और प्राइमर सेट प्रदान किए।
0.22µm sterile syringe filter | Labsolute | 7699822 | |
1.5 mL Safeseal tubes | Sarstedt | 7,27,06,400 | |
6x orange loading dye | Thermofisher | R0631 | |
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Bioruptor NGS | Diagenode | ||
Blade or Scalpel | |||
Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | HN04 | |
Chloroform | Sigma Aldrich (Merck) | C2432 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
Deacetylase Inhibitor | Active Motif | 37494 | |
Dounce tissue grinder set | Sigma Aldrich (Merck) | DWK885300-0001-1EA | |
EDTA 500 mM solution | PanReac AppliChem | A4892 | |
EGTA | Sigma Aldrich (Merck) | E4378 | |
EtBr | Carl Roth | 2218 | Concentration 10mg/mL |
Ethanol absolute | CHEMSOLUTE | 2273 | |
Glycerol | Sigma Aldrich (Merck) | G9012 | |
Glycin | Carl Roth | 0079 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | Concentration: 20mg/mL |
Heating block | |||
HEPES | Sigma Aldrich (Merck) | H4034 | |
LE Agarose | Biozym | 840000 | |
Liquid nitrogen cooled mini mortar | Bel-Art | H37260-0100 | |
MeOH free Formaldehyde 16% | Thermofisher | 28908 | |
NP-40 | Roche | 11332473001 | |
PBS 1x | Thermofisher | 10010015 | |
Pefabloc SC-Protease-Inhibitor | Sigma Aldrich (Merck) | 11429868001 | |
Phase Lock Gel – Heavy | QuantaBio | 2302830 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | Sigma Aldrich (Merck) | P3803 | |
Potassium chloride | Carl Roth | 6781 | |
Potassium hydroxyde | Merck | 105033 | |
Proteinase K | Lucigen | MPRK092 | Concentration: 50 µg/µL |
RNAse A | Lucigen | MRNA092 | Concentration: 5 mg/mL |
SDS 10% solution | PanReac AppliChem | A3950 | |
Sodium carbonate anhydrous | Carl Roth | A135 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich (Merck) | S7653 | |
Sterile Petri dishes | Sarstedt | 83,39,02,500 | |
Tris-HCl solution | Sigma Aldrich (Merck) | T2694 | |
Triton-X100 | Sigma Aldrich (Merck) | X100 |