Criando quimeras do prosencéfalo aviário para avaliar o desenvolvimento facial
Summary
Este artigo descreve uma técnica de transplante tecidual que foi projetada para testar as propriedades de sinalização e padronização do prosencéfalo basal durante o desenvolvimento craniofacial.
Abstract
O embrião aviário tem sido usado como um sistema modelo por mais de um século e levou à compreensão fundamental do desenvolvimento de vertebrados. Um dos pontos fortes desse sistema modelo é que o efeito e a interação entre os tecidos podem ser avaliados diretamente em embriões quiméricos. Mostramos anteriormente que sinais do prosencéfalo contribuem para a morfogênese facial regulando a forma do domínio de expressão do ouriço sônico (SHH) na Zona Ectodérmica Frontonasal (FEZ). Neste artigo, o método de gerar quimeras do prosencéfalo e fornecer ilustrações dos resultados desses experimentos é descrito.
Introduction
Muitas pesquisas contemporâneas em biologia do desenvolvimento se concentram no papel dos genes na formação de embriões. Existem boas ferramentas para examinar os mecanismos de desenvolvimento de uma perspectiva genética. No entanto, os embriões são montados e sofrem morfogênese em resposta às interações teciduais. O sistema aviário é uma ferramenta clássica usada para avaliar a variedade de interações teciduais que regulam o desenvolvimento pelas seguintes razões: a embriologia é bem compreendida, os embriões são facilmente acessíveis, as ferramentas para análise de sistemas aviários são bem desenvolvidas e os embriões são baratos.
O sistema de transplante aviário tem sido amplamente empregado para rastreamento de linhagens e para avaliar interações teciduais durante o desenvolvimentohá quase um século 1,2,3,4. Esse sistema foi utilizado para investigar um centro de sinalização, a Zona Ectodérmica Frontonasal (FEZ), que regula a morfogênese da mandíbulasuperior5, e um vídeo foi publicado descrevendo essa técnicaanteriormente6. Além das codornas-pintinhos, outras espécies também têm sido utilizadas na produção de quimeras para análise de interações teciduais. Por exemplo, o camundongo FEZ foi transplantado de camundongos selvagens tipo7 e mutantes8, e outros utilizaram os sistemas pato, codorna e pintinho para avaliar o papel da crista neural na padronização do esqueleto facial 9,10,11,12.
Neste trabalho, o papel do prosencéfalo na regulação do padrão de expressão gênica no FEZ através do transplante do prosencéfalo ventral reciprocamente entre embriões de codorna, pato e pintinho foi avaliado, pois um sinal do prosencéfalo é necessário para induzir a expressão do ouriço sônico no FEZ. Os transplantes de prosencéfalo não são únicos no campo. Esses transplantes foram utilizados para avaliar o desenvolvimento da motilidade em embriões de codornas epatos13, embora nesses experimentos também tenham sido transplantados tecidos que contribuíram para derivados não neurais. Em outros trabalhos, circuitos auditivos em aves foram avaliados por transplante de prosencéfalo14, mas esses transplantes continham células presuntivas da crista neural, que contribuem para a formafacial9,10 e participam da regulação da expressão de SHH noFEZ15. Assim, um sistema para transplantar apenas o prosencéfalo ventral de uma espécie de ave para outra antes do fechamento do tubo neural foi concebido para avaliar o papel do cérebro na forma facial16 (Figura 1A,B). Este método foi isento de contaminação da crista neural do enxerto. Neste artigo, o método é ilustrado e os resultados esperados são descritos, e os desafios enfrentados são discutidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito permite examinar as interações teciduais entre o prosencéfalo basal e o ectoderma adjacente. Essa abordagem difere dos métodos anteriores de transplante de prosencéfalo, pois o tecido doador era restrito ao prosencéfalo ventral. Isso elimina o transplante das células da crista neural, que comprovadamente participam da padronização da morfologiafacial9,10. Assim, a restrição do enxerto ao prosencéfalo basal foi essencial para avaliar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de prêmio R01DE019648, R01DE018234 e R01DE019638.
Materials
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35×10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
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