सिस्टिक फाइब्रोसिस वाले व्यक्तियों के फेफड़ों में बैक्टीरियल बायोफिल्म के एक स्थापित पूर्व वीवो मॉडल का उपयोग करके एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण करने के लिए इस कार्यप्रवाह का उपयोग किया जा सकता है। इस मॉडल का उपयोग एमबीईसी (न्यूनतम बायोफिल्म उन्मूलन एकाग्रता) परख की नैदानिक वैधता को बढ़ा सकता है।
सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) वाले व्यक्तियों के फेफड़ों के भीतर मौजूद बैक्टीरियल बायोफिल्म्स के लिए एंटीबायोटिक दवाओं का प्रभावी नुस्खा एंटीबायोटिक उपचार के बाद मानक नैदानिक विधियों (जैसे, शोरबा माइक्रोडिल्यूशन, डिस्क प्रसार, या एटेस्ट) और नैदानिक परिणामों का उपयोग करके एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण (एएसटी) परिणामों के बीच एक खराब संबंध से सीमित है। ऑफ-द-शेल्फ बायोफिल्म विकास प्लेटफार्मों के उपयोग से एएसटी में सुधार के प्रयास परिणामों में थोड़ा सुधार दिखाते हैं। सीएफ फेफड़ों के भौतिक रसायन वातावरण की नकल करने के लिए इन विट्रो बायोफिल्म सिस्टम की सीमित क्षमता और इसलिए बैक्टीरियल फिजियोलॉजी और बायोफिल्म आर्किटेक्चर, सीएफ संक्रमण के लिए उपन्यास चिकित्सा की खोज पर ब्रेक के रूप में भी कार्य करता है। यहां, हम एक पूर्व वीवो सीएफ फेफड़ों के मॉडल में परिपक्व के रूप में उगाए जाने वाले सीएफ रोगजनकों के एएसटी को करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जिसमें सुअर ब्रोंकिओलर ऊतक और सिंथेटिक सीएफ थूक (पूर्व वीवो सुअर फेफड़े, ईवीपीएल) शामिल थे।
बायोफिल्म संवेदनशीलता परीक्षण के लिए कई इन विट्रो परख मौजूद हैं, जो या तो मानक प्रयोगशाला माध्यम या माइक्रोटिटर प्लेटों में सिंथेटिक सीएफ थूक के विभिन्न योगों का उपयोग करते हैं। दोनों विकास माध्यम और बायोफिल्म सब्सट्रेट (पॉलीस्टीरिन प्लेट बनाम ब्रोनचिओलर ऊतक) बायोफिल्म एंटीबायोटिक सहिष्णुता को प्रभावित करने की संभावना है। हम पूर्व वीवो मॉडल में नैदानिक स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और स्टेफिलोकोकस ऑरियस आइसोलस की बढ़ी हुई सहिष्णुता दिखाते हैं; बायोफिल्म्स के एंटीबायोटिक उपचार का प्रभाव मानक माइक्रोडिल्यूशन परख में न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) या डिस्क प्रसार परख में संवेदनशील/प्रतिरोधी वर्गीकरण से सहसंबद्ध नहीं है ।
पूर्व वीवो मंच का उपयोग रोगी नमूनों के बेस्पोक बायोफिल्म एएसटी के लिए और दवा अनुसंधान और विकास के दौरान संभावित एंटीबायोफिल्म एजेंटों के लिए एक उन्नत परीक्षण मंच के रूप में किया जा सकता है। वीवो जैसे परीक्षण प्लेटफार्मों में अधिक के उपयोग के माध्यम से एंटीबायोफिल्म दवा खोज के पर्चे या त्वरण में सुधार करने से सीएफ वाले व्यक्तियों के लिए स्वास्थ्य परिणामों में काफी सुधार हो सकता है, साथ ही नैदानिक उपचार और खोज अनुसंधान की लागत को कम किया जा सकता है।
क्रोनिक बायोफिल्म संक्रमण व्यक्तियों को प्रभावित करते हैं जिनकी सामान्य प्रतिरक्षा सुरक्षा से समझौता किया जाता है। जोखिम में समूहों आनुवंशिक स्थिति सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF)1के साथ उन शामिल हैं । प्रारंभिक प्रारंभिक अवस्था में श्वसन तंत्र में असामान्य रूप से मोटी, चिपकने वाले बलगम का उपनिवेशीकरण ब्रोंकिओल्स2, 3के असभ्य बायोफिल्म संक्रमणों की ओरजाताहै। व्यापक मैट्रिक्स-एनकैप्सुलेटेड बायोफिल्म्स के रूप में बैक्टीरिया का विकास एक कारक है जो इम्यूनोसमझीज़ के पुराने संक्रमणों को स्वस्थ मेजबानों के तीव्र संक्रमणों से अलग करता है और बायोफिल्म राज्य दोनों एंटीबायोटिक एक्सपोजर (मैट्रिक्स के माध्यम से कम प्रसार के कारण) बैक्टीरिया को बचाता है और उनकी एंटीबायोटिक संवेदनशीलता (जैसे, प्रेरण क्विसेंस या अलक्स पंपों के अपरज्येशन के माध्यम से)4,5. हालांकि, मेजबान ऊतक शरीर विज्ञान और रसायन विज्ञान में रोग-विशिष्ट परिवर्तन तीव्र संक्रमणों या मानक प्रयोगशाला विकास स्थितियों में देखे गए बैक्टीरियल फिजियोलॉजी को और बदल देते हैं। सीएफ में प्रमुख उदाहरणों में असामान्य कार्बन स्रोतों का उपयोग शामिल है, जैसे कि फेफड़ों के सर्फेक्टेंट से जारी फैटी एसिड और अमीनो एसिड और म्यूसिन के माइक्रोबायल क्षरण, सूक्ष्म पोषक तत्वों की रिहाई, जैसे क्षतिग्रस्त ऊतकों से लोहा, और माइक्रोएरोबियोसिस6,7,8।
एक विशेष बायोफिल्म संक्रमण संदर्भ में विशिष्ट भौतिक रसायन की स्थिति इसलिए एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकती है। सबसे पहले, एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स की संरचना और गहराई स्थानीय पर्यावरणीय स्थितियों पर निर्भर करती है, जैसे पोषक तत्व या कतरनी बल। दूसरा, पर्यावरण संकेत विशिष्ट एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन की अभिव्यक्ति को ट्रिगर कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, सीएफ रोगजनक स्यूडोमोनास एरुगिनोसा सीएफ थूक बनाम इन विट्रो9में बीटा-लैक्टामाज़ की अभिव्यक्ति और कम अभिव्यक्ति दिखाता है, जबकि एक अन्य सीएफ रोगजनक, बर्कहोल्डरिया सेनोसेपिया,सीएफ थूक10में उगाए जाने पर बीटा-लैक्टामास और एफ्लक्स पंपों को बढ़ा देता है। तीसरा, इन-होस्ट स्थितियां एंटीबायोटिक-सहिष्णु फेनोटाइप के लिए एक शारीरिक या आनुवंशिक स्विच को क्यू कर सकती हैं, जो विट्रो में पुनः दोहराना मुश्किल है। इनमें सीएफ रोगजनक स्टेफिलोकोकस ऑरियस11,12के छोटे कॉलोनी वेरिएंट शामिल हैं ।
इन सभी आंकड़ों से संकेत मिलता है कि जब नैदानिक प्रयोगशालाएं रोगजनक बायोफिल्म से व्यक्तिगत क्लोन को अलग करती हैं और मानक प्रयोगशाला मीडिया (शोरबा माइक्रोडिल्यूशन, डिस्क प्रसार या एटेस्ट) में प्लैंक्टोनिक या एगर-प्लेट उगाई गई संस्कृतियों पर एएसटी प्रदर्शन करती हैं, तो परिणाम अक्सर यह भविष्यवाणी नहीं करते हैं कि कौन सी एंटीबायोटिक्स वास्तव में वीवो में काम करेंगी। यहां तक कि अगर इन विट्रो बायोफिल्म परख का उपयोग किया जाता है, तो वे उपयोग की जाने वाली मध्यम और लगाव सतह में मतभेदों के कारण वीवो-जैसे बायोफिल्म फेनोटाइप में क्यू नहीं कर सकते हैं, इसलिए प्रवाह कोशिकाओं या उच्च-थ्रूपुट माइक्रोप्लेट प्लेटफार्मों का उपयोग करके परख एंटीबायोटिक संवेदनशीलता13का अनुमान लगा सकते हैं। यही समस्या शिक्षा और उद्योग के शोधकर्ताओं पर लागू होती है जो नए एंटीबायोफिल्म एजेंटों को विकसित करने की मांग करते हैं: प्रवाह कोशिकाओं, माइक्रोटिटर प्लेटों, या सेंटर फॉर डिजीज कंट्रोल बायोफिल्म रिएक्टरों जैसे इन विट्रो प्लेटफार्मों का उपयोग करके दवा क्षमता का परीक्षण बायोफिल्म प्रभावकारिता बार को बहुत कम सेट कर सकता है और अनुसंधान, विकास पाइपलाइन में झूठी सकारात्मक का उत्पादन कर सकता है।
सीएफ में एंटीबायोटिक उपचार के बाद एएसटी परिणामों और नैदानिक परिणामों के बीच खराब सहसंबंध अच्छी तरह से जाना जाता है। कई चिकित्सकों बस नैदानिक प्रयोगशाला AST की अनदेखी के रूप में वहां कोई समान, CF इन परिणामों की व्याख्या के लिए विशिष्ट दिशा निर्देश है और इसके बजाय निर्धारित करने के लिए मामला द्वारा मामले निर्णय करते हैं । कैलगरी बायोफिल्म डिवाइस का उपयोग करके सीएफ एएसटी में सुधार करने के प्रयास किए गए हैं, जो मानक एएसटी माध्यम (जैसे, सीईन-समायोजित मुलर-हिंटन शोरबा)14, 15वाले माइक्रोप्लेट के कुओं के भीतर सेट प्लास्टिक खूंटे की सतह पर उगाए गए बायोफिल्म का उपयोग करता है। यह परख यह भविष्यवाणी करने में बेहतर नहीं है कि कौन सी एंटीबायोटिक्स वीवो में मानक प्लैंक्टोनिक एएसटी16की तुलना में काम करेंगी । सीएफ के साथ रोगियों पर प्रभाव स्टार्क है । दोहराया एंटीबायोटिक प्रशासन के बावजूद (नियमित रूप से सांस एंटीबायोटिक दवाओं और 27 दिनों की एक औसत/यूनाइटेड किंगडम में CF के साथ व्यक्तियों के लिए नसों में एंटीबायोटिक दवाओं प्राप्त)17,तीव्र फेफड़े की तीव्रता के लगातार और अप्रत्याशित एपिसोड प्रगतिशील फेफड़ों की क्षति के लिए सीसा और, मामलों के लगभग ९०% में, श्वसन विफलता से मौत । हाल ही में एक विश्लेषण में, जीवाणु फेफड़ों के संक्रमण CF में दवा की लागत का सबसे मजबूत कारक था, औसत € 3.6K/रोगी/वर्ष पर जोड़ने के लिए सीधे स्वास्थ्य देखभाल लागत18,19।
अन्यथा स्वस्थ व्यक्तियों के तीव्र संक्रमणों के लिए, वर्तमान अनुसंधान और नीति तेजी से एएसटी पर ध्यान केंद्रित कर रही है, उदाहरण के लिए, पॉइंट-ऑफ-केयर जीनोमिक भविष्यवाणी आदर्श20है। लेकिन क्रोनिक सीएफ संक्रमणों के मामले में, यह स्पष्ट है कि एक अलग दृष्टिकोण की आवश्यकता है: मेजबान-नकल करने वाले मॉडलों में एएसटी का कार्यान्वयन जो वीवो पर्यावरण और रोगजनक मेटाबोलिक राज्य में बेहतर पुनर्पूंजीकरण करता है और यथार्थवादी बायोफिल्म संरचना के गठन के लिए अनुमति देता है।
हमने पहले एक सीएफ बायोफिल्म मॉडल विकसित किया है जिसमें सिंथेटिक सीएफ थूक में इनक्यूबेटेड सुअर ब्रोंकिओल के खंड शामिल हैं और पी एरुगिनोसा या एस ऑरियससे संक्रमित हैं। असंक्रमित ईवीपीएल 7 दिनों तक सामान्य हिस्टोपैथोलॉजी को बरकरार रखता है लेकिन पी एरुगिनोसा और एस ऑरियस के प्रयोगशाला या नैदानिक आइसोले ऊतक के चारों ओर वीवो जैसे समुच्चय में पुन: रूप देते हैं, जो सीएफ संक्रमण21, 22,23के एटियोलॉजी की नकल करतेहैं। हम इस उच्च वैधता, उच्च थ्रूपुट मॉडल का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो सीएफ के लिए एक सिलवाया बायोफिल्म एएसटी प्लेटफॉर्म के रूप में है और मॉडल में उगाए जाने पर रोगजनक बायोफिल्म की उच्च सहनशीलता को चिकित्सकीय रूप से उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक दवाओं के लिए उच्च सहिष्णुता दिखाने वाले अनुकरणीय परिणाम प्रस्तुत करते हैं। मॉडल आसानी से अनुसंधान में शामिल किया जा सकता है, प्रबंधन या बायोफिल्म गठन की रोकथाम के लिए विकास पाइपलाइनों और संभावित नैदानिक एएसटी में । उपयोग किए गए अधिकांश उपकरण (सामग्री की तालिका देखें) आसानी से एक विशिष्ट माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला में पाए जा सकते हैं, हालांकि एक मनका डिब्बा आवश्यक है, और हमने सहयोगियों के साथ काम से पाया है कि एक उपयुक्त पराबैंगनी रोगाणुगतिशील कैबिनेट को भी खरीदने की आवश्यकता हो सकती है। के रूप में फेफड़ों वाणिज्यिक कसाई या बूचड़खानों से sourced हैं, मॉडल कोई नैतिक चिंताओं को प्रस्तुत करता है ।
पूर्व वीवो फेफड़ों मॉडल उच्च थ्रूपुट और सस्ती है और, क्योंकि यह मांस उद्योग से उपभोक्ता कचरे के बाद का उपयोग करता है, यह कोई नैतिक चिंताओं को प्रस्तुत करता है । यह लंबे समय से संक्रमित मानव CF एयरवेज वर्तमान में उपलब्ध से बेहतर नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, इन विट्रो AST प्लेटफार्मों । यहां प्रस्तुत परिणामों से पता चलता है कि यह अधिक सही इन परिस्थितियों में एंटीबायोटिक संवेदनशीलता की भविष्यवाणी कर सकते हैं ।
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम, जो यह सुनिश्चित करेंगे, विश्वसनीय और प्रजनन योग्य परिणाम निम्नलिखित शामिल हैं:
यह प्रोटोकॉल पी ऑरुगिनोसाके साथ उपयोग के लिए एक मजबूत प्रोटोटाइप मॉडल का उत्पादन करता है, जिसमें एस ऑरियसके साथ उपयोग के लिए विकास की एक बड़ी क्षमता है, लेकिन इसमें कुछ सीमाएं हैं जिन्हें भविष्य में कुछ अनुप्रयोगों के लिए संबोधित करने की आवश्यकता होगी। क्लोनल आबादी के विकास की अनुमति देने के लिए ऊतक को एकल उपनिवेशों से टीका लगाया गया था। परिणाम बताते है कि, पी aeruginosaके लिए, यह ४८ घंटे पर सेल संख्या पर थोड़ा प्रभाव पड़ता है । हालांकि, एस ऑरियस के लिए बैक्टीरियल लोड में अधिक परिवर्तनशीलता देखी गई थी और यह देखते हुए कि विभिन्न बैक्टीरिया मॉडल के भीतर अलग-अलग बढ़ सकते हैं, एक मानकीकृत प्रारंभिक शुरुआती और समान आकार और वजन के ऊतकों के नमूनों का कठोर उत्पादन अध्ययन के जीव पर निर्भर हो सकता है। सटीक विच्छेदन/संक्रमण तकनीकों या स्थानीय सुअर नस्ल/लैंडरेस में अंतर के कारण प्रयोगशालाओं के बीच मतभेद भी हो सकते हैं । मॉडल के व्यक्तिगत कार्यान्वयन के लिए जीवाणु आबादी की प्रजनन क्षमता का आकलन करने के लिए, हमपरिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण के भाग के रूप में पुनरावृत्ति गणना के उपयोग और अंतिम प्रयोगों में उनके उपयोग के लिए इष्टतम नमूना आकार की गणना करने के लिए प्रायोगिक प्रयोगों के आधार पर पुनरावृत्ति/शक्ति गणना के उपयोग का सुझाव देते हैं ।
पारंपरिक प्लेट परख पर EVPL के प्रमुख फायदों में से एक यह है कि, प्लैंकटोनिक रूप से या अजैविक सतहों पर बढ़ रहे बैक्टीरिया के लिए परीक्षण करने के बजाय, यह एक मेजबान वातावरण के भीतर और सेल भेदभाव के साथ बैक्टीरियल बायोफिल्म्स की स्थानिक संरचना के लिए अनुमति देता है। यह रोगाणुरोधी एजेंटों की गतिविधि पर फिजियोकेमिकल और पोषक तत्वों के ढाल के प्रभाव के साथ-साथ एक पुराने संक्रमण और बैक्टीरिया के बीच सेल-सेल बातचीत के भीतर विभिन्न माइक्रोएनवायरमेंट्स पर सक्रिय उपचारों की डिलीवरी और उपलब्धता पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं। यह उत्तरार्द्ध बिंदु विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि बहुप्रजाति संक्रमण नियमित रूप से सीएफ में देखे जाते हैं और अस्थमा और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज जैसी अन्य श्वसन स्थितियों से जुड़े संक्रमणों के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं । नैदानिक निदान में व्यक्तिगत रोगी थूक नमूने के लिए एएसटी के लिए इस मॉडल को विकसित करने की क्षमता है। एक अनुरूप परीक्षण पहले से ही विकास के लिए विट्रो मॉडल में एक घाव नकल उतार रहा है और पुराने घावों से debrided बायोफिल्म के AST (दक्षिण पश्चिम क्षेत्रीय घाव देखभाल केंद्र Lubbock, टेक्सास, डॉ आर Wolcott में) ।
इसके अलावा, मॉडल पोस्टमार्टम ऊतक का उपयोग करता है, तो एंटीबायोटिक संवेदनशीलता पर मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का प्रभाव सीमित है । वर्तमान इन विट्रो मॉडल भी मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए खाते में नहीं है, तो हम इसे एएसटी अनुप्रयोगों में मॉडल के भविष्य के उपयोग के लिए एक बाधा के रूप में नहीं देखते हैं । हालांकि, जब फार्माकोकाइनेटिक और फार्माकोडायनामिक पैरामीटर और एंटीबायोटिक डोजिंग दिशानिर्देश निर्धारित किए जाते हैं तो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ध्यान में रखा जाता है। यद्यपि हमारे अध्ययनों ने ऊतक23 (और एस अजीमी, व्यक्तिगत संचार) के भीतर अवशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं और प्रतिक्रियाओं के सबूत दिखाए हैं, यह मॉडल के आगे अनुकूलन और विकास के लिए एक प्रमुख क्षेत्र है यदि वीवो स्थितियों में अधिक से अधिक मैच वांछित है।
सीएफ के लिए अधिक चिकित्सकीय रूप से वैध तास्ट प्रदान करने से यूके स्वास्थ्य, सामाजिक देखभाल अधिनियम 2008 की एक प्रमुख सिफारिश को पूरा करने में मदद मिलेगी कि “प्रक्रियाएं विवेकपूर्ण विहित और रोगाणुरोधी प्रबंधन सुनिश्चित करने के लिए होनी चाहिए। हमारा मानना है कि EVPL इस जरूरत को पूरा करने में मदद करने के लिए एक आदर्श उम्मीदवार मॉडल है ।
The authors have nothing to disclose.
हम अपने सभी सह-लेखकों को उन मूल पत्रों पर धन्यवाद देते हैं जिनसे हमने अनुकरणीय परिणाम लिए हैं । इस कार्य को एफएच को दिए गए एमआरसी न्यू इन्वेसक्रूज रिसर्च ग्रांट (अनुदान संख्या एमआर/आर001898/1)द्वारा वित्त पोषित किया गया था; बीएचएसआरसी मिडलैंड्स इंटीग्रेटिव बायोसाइंसेज ट्रेनिंग पार्टनरशिप (एमआईबीटीपी) से पीएचडी स्टूडेंटशिप द्वारा एनईएच और आईए को सम्मानित किया गया; और यूनिवर्सिटी ऑफ वारविक अंडरग्रेजुएट रिसर्च सपोर्ट स्कीम के अवार्ड द्वारा एफए को समर वेकेशन रिसर्च प्रोजेक्ट का संचालन करने के लिए । हम फेफड़ों की आपूर्ति के लिए स्टीव क्विग्ले, संस (क्यूबिंगटन, वार्विशायर) और जॉन टेलर, बेटे (अर्लस्डेन, कोवाट्री) का शुक्रिया अदा करते हैं । हम भी वारविक विश्वविद्यालय में जीवन विज्ञान के स्कूल में मीडिया की तैयारी की सुविधा की मदद को स्वीकार करना चाहते हैं, सेरिथ Harries और कैरोलीन स्टीवर्ट के लिए विशेष धंयवाद के साथ, और वारविक एंटीमाइक्रोबियल स्क्रीनिंग सुविधा में अनीता कैथवुड की मदद ।
0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached | |||
24-well culture plates | |||
70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment | |||
Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium) | |||
Agarose | |||
Aluminum foil – pre-sterilised by autoclaving – to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs. | |||
Bead beater designed to take 2 mL tubes | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system |
Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates | Diversified Biotech | BEM-1 or BERM-2000 | |
Bunsen burner | |||
Chopping board – we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol. | |||
Coolbox to transport lungs to lab | |||
Dissection scissors in different sizes | |||
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | |||
Fisherbrand 2 mL reinforced tubes | Thermo Fisher | 15545809 | |
Fisherbrand 2.38 mm metal beads | Thermo Fisher | 15505809 | |
Germicidal UV cabinet | |||
Insulin syringes - 0.5 mL with 29G needle attached. | VWR | BDAM324892 | |
Large pallet knife | |||
LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate | |||
Mounted razor blades | |||
Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit | Thermo Fisher | 10474415 | For filter-sterilizing SCFM |
Petri dishes | |||
Phosphate-buffered saline | |||
Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface | |||
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | |||
SCFM ingredients as listed in Table S1 | |||
Selection of forceps (blunt tips recommended) | |||
Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required. | |||
Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies. |