Denne arbejdsgang kan bruges til at udføre antibiotika modtagelighed test ved hjælp af en etableret ex vivo model af bakteriel biofilm i lungerne hos personer med cystisk fibrose. Anvendelsen af denne model kan øge den kliniske validitet af MBEC -assays (minimal koncentration af biofilmudryddelse).
Den effektive recept på antibiotika til bakterielle biofilm, der findes i lungerne hos personer med cystisk fibrose (CF), er begrænset af en dårlig sammenhæng mellem resultaterne af antibiotikafølsomhedstest (AST) ved hjælp af standarddiagnostiske metoder (f.eks. bouillonmikrodilution, diskspredning eller Etest) og kliniske resultater efter antibiotikabehandling. Forsøg på at forbedre AST ved brug af off-the-shelf biofilm vækstplatforme viser ringe forbedring i resultaterne. Den begrænsede evne til in vitro biofilm systemer til at efterligne den fysisk-kemiske miljø CF lunge og derfor bakteriel fysiologi og biofilm arkitektur, fungerer også som en bremse på opdagelsen af nye behandlinger for CF-infektion. Her præsenterer vi en protokol til at udføre AST af CF patogener dyrket som modne, in vivo-lignende biofilm i en ex vivo CF lunge model bestående af svin bronchiolar væv og syntetisk CF sputum (ex vivo svin lunge, EVPL).
Der findes flere in vitro-assays til biofilmfølsomhedstest, der enten anvender standardlaboratoriemedium eller forskellige formuleringer af syntetisk CF-spyt i mikrotiterplader. Både vækstmedium og biofilmsubstrat (polystyrenplade vs. bronchiolarvæv) vil sandsynligvis påvirke biofilmens antibiotikatolerance. Vi udviser øget tolerance over for kliniske Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus isolater i ex vivo-modellen; virkningerne af antibiotikabehandling af biofilm er ikke korreleret med den minimale hæmmende koncentration (MIC) i standardanalyser af mikrodilution eller en følsom/resistent klassificering i diskforståelsesanalyser.
Ex vivo-platformen kunne bruges til skræddersyet biofilm AST af patientprøver og som en forbedret testplatform for potentielle antibiofilmmidler under farmaceutisk forskning og udvikling. Forbedring af recept eller acceleration af antibiofilm lægemiddel opdagelse ved hjælp af mere in vivo-lignende testplatforme kunne drastisk forbedre sundhedsmæssige resultater for personer med CF, samt reducere omkostningerne ved klinisk behandling og opdagelse forskning.
Kroniske biofilminfektioner påvirker personer, hvis normale immunforsvar er kompromitteret. Risikogrupper omfatter personer med den genetiske tilstand cystisk fibrose (CF)1. Kolonisering af det unormalt tykke, klæbende slim i luftvejene i tidlig barndom fører til vanskelige biofilminfektioner i bronchiolerne2,3. Væksten af bakterier som omfattende matrix-indkapslede biofilm er en faktor, der adskiller kroniske infektioner hos immunkompromitterede mennesker fra akutte infektioner hos raske værter, og biofilmtilstanden beskytter begge bakterier mod antibiotikaeksponering (på grund af reduceret diffusion gennem matrixen) og reducerer deres antibiotikafølsomhed (f.eks. gennem induktion af quiescence eller opregulering af effluxpumper)4,5. Sygdomsspecifikke ændringer i værtsvævsfysiologi og kemi ændrer imidlertid yderligere bakteriel fysiologi fra den, der observeres i akutte infektioner eller i standardlaboratorievækstforhold. Nøgleeksempler i CF omfatter brugen af usædvanlige kulstofkilder, såsom fedtsyrer og aminosyrer frigivet fra lungeaktivt overfladeaktivt middel og produceret ved mikrobiel nedbrydning af mucin, frigivelse af mikronæringsstoffer, såsom jern fra beskadiget væv, og mikroaerobiose6,7,8.
De specifikke fysiskkemiske tilstande i en bestemt biofilminfektionssammenhæng kan derfor påvirke reaktionerne på antibiotika. For det første afhænger strukturen og dybden af den ekstracellulære matrix af lokale miljøforhold, såsom næringsstoffer eller forskydningskræfter. For det andet kan miljømæssige signaler udløse udtryk for specifikke antibiotikaresistens gener. For eksempel viser CF-patogenet Pseudomonas aeruginosa øget udtryk for en beta-lactamase og reduceret ekspression af poriner i CF-sputum versus in vitro9, mens en anden CF-patogen, Burkholderia cenocepacia, upregulates beta-lactamases og efflux pumper, når de dyrkes i CF sputum10. For det tredje kan in-host betingelser cue en fysiologisk eller genetisk skifte til antibiotika-tolerante fænotyper, som er svære at opsummere in vitro. Disse omfatter små kolonivarianter af CF-patogenet Staphylococcus aureus11,12.
Alle disse data tyder på, at når diagnostiske laboratorier isolere individuelle kloner fra patogene biofilm og udføre AST på planktoniske eller agar-plade dyrkede kulturer i standard laboratoriemedier (bouillon mikrodilution, disk diffusion eller Etest), resultaterne ofte ikke forudsige, hvilke antibiotika rent faktisk vil arbejde in vivo. Selv hvis der anvendes in vitro-biofilmanalyser, må de ikke give næring til en in vivo-lignende biofilmphoenotype på grund af forskelle i den anvendte medium- og fastgørelsesoverflade, så assays ved hjælp af flowceller eller mikropladeplatforme med høj gennemstrømning kan overvurdere antibiotikafølsomheden13. Det samme problem gælder for forskere i den akademiske verden og industrien, der søger at udvikle nye antibiofilmmidler: Test af lægemiddelpotentiale ved hjælp af in vitro-platforme som flowceller, mikrotiterplader eller Center for Disease Control biofilmreaktorer kan indstille biofilmeffektivitetsbjælken for lavt og producere falske positiver i forsknings-, udviklingspipeline.
Den dårlige sammenhæng mellem AST resultater og kliniske resultat efter antibiotikabehandling i CF er velkendt. Mange klinikere simpelthen ignorere diagnostiske lab AST, da der ikke er nogen ensartede, CF-specifikke retningslinjer for fortolkning af disse resultater og i stedet gøre sag-til-sag beslutninger for ordination. Der er gjort forsøg på at forbedre CF AST ved hjælp af Calgary biofilm enhed, der bruger biofilm dyrket på overfladen af plastpløkker, der er fastsat i brøndene på en mikroplade, der indeholder standard AST medium (f.eks kation-justeret Muller-Hinton bouillon)14,15. Denne analyse gør ikke bedre til at forudsige, hvilke antibiotika vil arbejde in vivo end standard planktonisk AST16. Indvirkningen på patienter med CF er skarp. På trods af gentagen indgift af antibiotika (almindelig inhaleret antibiotika og en median på 27 dage om året, der modtager intravenøs antibiotika for personer med CF i Det Forenede Kongerige)fører hyppigeog uforudsigelige episoder med akut lungeforværring til progressiv lungeskade og i ca. 90 % af tilfældene død som følge af respirationssvigt. I en nylig analyse, bakteriel lungeinfektion var den stærkeste prædiktor for medicin omkostninger i CF, tilføjer i gennemsnit € 3.6K/patient/ år til direkte udgifter til sundhedspleje18,19.
For akutte infektioner af ellers raske individer er aktuel forskning og politik med fokus på hurtig AST baseret på for eksempel point-of-care genomisk forudsigelse ideel20. Men i tilfælde af kroniske CF-infektioner er det klart, at der er behov for en anden tilgang: implementeringen af AST i værtslignende modeller, der bedre opsummerer in vivo-miljøet og patogenmetabolisk tilstand og giver mulighed for dannelse af realistisk biofilmstruktur.
Vi har tidligere udviklet en CF biofilm model, der omfatter dele af svin bronchiole inkuberet i syntetisk CF sputum og inficeret med P. aeruginosa eller S. aureus. Upåvirket EVPL bevarer normal histopatologi i 7 dage, men lab eller kliniske isolater af P. aeruginosa og S. aureus reproducerbart form i vivo-lignende aggregater omkring vævet, efterligner etiologi af CF-infektion21,22,23. Vi præsenterer en protokol for brug af denne høj gyldighed, høj gennemstrømningshastighedsmodel som en skræddersyet biofilm AST-platform til CF og præsenterer eksemplariske resultater, der viser den høje tolerance over for patogenbiofilm til klinisk anvendte antibiotika, når de dyrkes i modellen. Modellen kunne let indarbejdes i forskning, udviklingspipelines til styring eller forebyggelse af biofilmdannelse og potentielt i diagnostisk AST. Det meste af det anvendte udstyr (se Materialetabel) kan let findes i et typisk mikrobiologisk laboratorium, selv om en perlebanker er afgørende, og vi har fundet ud af arbejdet med samarbejdspartnere, at et passende ultraviolet germicidalskab muligvis også skal indkøbes. Da lungerne kommer fra kommercielle slagtere eller slagterier, giver modellen ingen etiske bekymringer.
Ex vivo-lungemodellen er høj gennemløb og billig, og fordi den bruger affald fra kødindustrien efter forbrug, giver den ingen etiske betænkeligheder. Det er designet til at efterligne kronisk inficerede menneskelige CF-luftveje bedre end i øjeblikket tilgængelige, in vitro AST-platforme. Resultater præsenteret her viser, at det mere præcist kan forudsige antibiotika modtagelighed under disse omstændigheder.
Kritiske trin i protokollen, der sikrer pålidelige og reproducerbare resultater, omfatter følgende:
Denne protokol producerer en robust prototypemodel til brug med P. aeruginosa, med et stort udviklingspotentiale til brug med S. aureus, men den har nogle begrænsninger, der skal løses for visse applikationer i fremtiden. Væv blev podet fra enkelte kolonier for at muliggøre udviklingen af klonpopulationer. Resultaterne viser, at for P. aeruginosahar dette ringe indflydelse på cellenumre ved 48 timer. Der blev dog observeret større variation i bakteriebelastningen for S. aureus, og da forskellige bakterier kan vokse forskelligt inden for modellen, kan en standardiseret start inoculum og streng produktion af vævsprøver af samme størrelse og vægt være afhængig af forsøgsorganismen. Der kan også være forskelle mellem laboratorier på grund af forskelle i præcise dissektion / infektion teknikker eller lokale svin race / landrace. For at vurdere bakteriepopulationernes reproducerbarhed ved individuelle implementeringer af modellen foreslår vi, at der anvendes repeterbarhedsberegninger som en del af den statistiske analyse af resultat25 og anvendelse af repeterbarheds-/effektberegninger baseret på pilotforsøg til at beregne den optimale prøvestørrelse til deres anvendelse i endelige forsøg.
En af de vigtigste fordele ved EVPL i forhold til traditionelle pladeanalyser er, at i stedet for at teste for bakterier, der vokser planktonisk eller på abiotiske overflader, giver det mulighed for rumlig strukturering af bakterielle biofilm i et værtsmiljø og med celledifferentiering. Dette har vigtige konsekvenser for at overveje virkningen af fysiokemiske og næringsstofgradienter på antimikrobielle stoffers aktivitet samt levering og tilgængelighed af aktive terapier ved forskellige mikromiljøer inden for en kronisk infektion og cellecelleinteraktion mellem bakterier. Sidstnævnte punkt er særlig vigtigt, da multiartsinfektioner rutinemæssigt observeres i CF og bliver stadig vigtigere for infektioner forbundet med andre luftvejssygdomme, såsom astma og kronisk obstruktiv lungesygdom. Der er potentiale til at udvikle denne model for AST for individualiseret patient sputum prøveudtagning i den kliniske diagnostik. En analog forsøg er allerede i gang ved hjælp af et sår-efterligne in vitro model for vækst og AST af debrided biofilm fra kroniske sår (Southwest Regional Wound Care Center i Lubbock, Texas, Dr. R. Wolcott).
Desuden bruger modellen post mortem-væv, så værts immunresponsets indflydelse på antibiotikafølsomheden er begrænset. Nuværende in vitro-modeller tager heller ikke højde for værtens immunrespons, så vi ser ikke dette som en hindring for den fremtidige brug af modellen i AST-applikationer. Immunresponset tages dog i betragtning, når farmakokinetiske og farmakodynamiske parametre og retningslinjer for dosering af antibiotika bestemmes. Selvom vores undersøgelser har vist tegn på resterende immunceller og reaktioner i vævet23 (og S. Azimi, personlig kommunikation), er dette et førsteklasses område for yderligere optimering og udvikling af modellen, hvis der ønskes et større match til in vivo-forhold.
Give mere klinisk gyldig AST for CF vil bidrage til at opfylde en vigtig anbefaling fra den britiske Health, Social Care Act 2008, at “procedurer bør være på plads for at sikre en forsigtig ordination og antimikrobiel forvaltning.” Vi mener, at EVPL er en ideel kandidatmodel til at hjælpe med at opfylde dette behov.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle vores medforfattere på de originale papirer, hvorfra vi har taget eksemplariske resultater. Arbejdet blev finansieret af en MRC New Investigator Research Grant (tilskud nummer MR/R001898/1)tildelt FH; af ph.d.-studerende fra BBSRC Midlands Integrative Biosciences Training Partnership (MIBTP), der tildeles NEH og IA og af University of Warwick Undergraduate Research Support Scheme’s tildeling til FA til at gennemføre en sommerferie forskningsprojekt. Vi takker Steve Quigley, Sons (Cubbington, Warwickshire) og John Taylor, Son (Earlsden, Coventry) for at levere lunger. Vi vil også gerne anerkende hjælp fra Media Preparation Facility i School of Life Sciences ved University of Warwick, med særlig tak til Cerith Harries og Caroline Stewart, og hjælp fra Anita Catherwood på Warwick Antimicrobial Screening Facility.
0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached | |||
24-well culture plates | |||
70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment | |||
Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium) | |||
Agarose | |||
Aluminum foil – pre-sterilised by autoclaving – to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs. | |||
Bead beater designed to take 2 mL tubes | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system |
Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates | Diversified Biotech | BEM-1 or BERM-2000 | |
Bunsen burner | |||
Chopping board – we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol. | |||
Coolbox to transport lungs to lab | |||
Dissection scissors in different sizes | |||
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | |||
Fisherbrand 2 mL reinforced tubes | Thermo Fisher | 15545809 | |
Fisherbrand 2.38 mm metal beads | Thermo Fisher | 15505809 | |
Germicidal UV cabinet | |||
Insulin syringes - 0.5 mL with 29G needle attached. | VWR | BDAM324892 | |
Large pallet knife | |||
LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate | |||
Mounted razor blades | |||
Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit | Thermo Fisher | 10474415 | For filter-sterilizing SCFM |
Petri dishes | |||
Phosphate-buffered saline | |||
Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface | |||
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | |||
SCFM ingredients as listed in Table S1 | |||
Selection of forceps (blunt tips recommended) | |||
Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required. | |||
Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies. |