En 3D-kartografisk beskrivelse af cellen ved Hjælp af Cryo Soft X-ray Tomography

Summary

Her præsenteres en protokol, der beskriver de prøveforberedelses- og dataindsamlingstrin, der kræves i kryo blød røntgentomografi (SXT) for at afbilde ultrastrukturen af hele kryokonserverede celler i en opløsning på 25 nm halv tonehøjde.

Abstract

Billeddannelsesteknikker er grundlæggende for at forstå celleorganisation og maskiner i biologisk forskning og de beslægtede områder. Blandt disse teknikker tillader cryo soft X-ray tomography (SXT) billeddannelse af hele kryo-bevarede celler i vandvinduet røntgenenergiområde (284-543 eV), hvor kulstofstrukturer har iboende højere absorption end vand, hvilket muliggør 3D-rekonstruktion af den lineære absorptionskoefficient for materialet indeholdt i hver voxel. Kvantitativ strukturel information på niveau med hele celler op til 10 μm tyk kan derefter opnås på denne måde med høj gennemstrømning og rumlig opløsning ned til 25-30 nm halv tonehøjde. Cryo-SXT har vist sig relevant for den nuværende biomedicinske forskning, idet den har givet 3D-information om cellulære infektionsprocesser (virus, bakterier eller parasitter), morfologiske ændringer på grund af sygdomme (såsom recessive genetiske sygdomme) og hjulpet os med at forstå lægemiddelhandling på celleniveau eller lokalisere specifikke strukturer i det 3D-cellulære miljø. Ved at drage fordel af den indstillelige bølgelængde ved synkrotronfaciliteter kan spektromikroskopi eller dens 3D-modstykke, spektrotomografi, også bruges til at afbilde og kvantificere specifikke elementer i cellen, såsom calcium i biomineraliseringsprocesser. Cryo-SXT giver supplerende information til andre biologiske billeddannelsesteknikker såsom elektronmikroskopi, røntgenfluorescens eller synlig lysfluorescens og bruges generelt som en partnermetode til 2D- eller 3D-korrelativ billeddannelse ved kryogene forhold for at forbinde funktion, placering og morfologi.

Introduction

Cryo-SXT kan spille en central rolle i biologisk billeddannelsesforskning, da det giver 3D-medium opløsning (25-30 nm halv tonehøjde) volumener af hydrerede hele celler 1,2,3,4,5,6. I vandvinduets energiområde, mellem kulstof- og iltabsorptionen K-kanterne (4,4-2,3 nm), absorberer kulstofrige cellulære strukturer 10 gange mere end det iltrige medium, der gennemsyrer og omgiver dem. I dette energiområde kan glaserede celler op til 10 μm tykkelse afbildes uden behov for sektionering eller farvning, hvilket fører til kvantitative højabsorptionskontrastfremskrivninger, som kombineret med prøverotationsfunktioner muliggør tomografisk rekonstruktion af den cellulære struktur. Cryo-SXT udfylder en niche med hensyn til prøvedimensioner og rumlig opløsning, der ikke er let tilgængelig med nogen anden billeddannelsesteknik.

Kort sagt er absorptionskontrasten af cryo-SXT kvantitativ, da dæmpning af fotonerne gennem prøven af tykkelse t adlyder Beer-Lambert-loven som følger: , hvor I₀ repræsenterer hændelsesintensiteten og μ_l den lineære absorptionskoefficient, som afhænger af bølgelængden λ og den imaginære del β af prøvens brydningsindeks ( ). Dæmpningen er en funktion af den biokemiske sammensætning og tykkelsen af de strukturer, der afbildes, hvor hver biokemisk komponent har en specifik røntgen lineær absorptionskoefficient μ_l (LAC). Det betyder, at hver tomografi voxelværdi afhænger af de kemiske elementer og deres koncentration i den voxel⁷. Dette muliggør naturlig diskrimination af forskellige organeller såsom kerner, nukleoler, lipidlegemer eller mitokondrier eller forskellige komprimeringstilstande af kromatin udelukkende baseret på deres iboende LAC-værdier rekonstrueret ^2,8,9.

Derudover er cryo-SXT en teknik med høj gennemstrømning, hvor tomogrammer indsamles på få minutter. Dette muliggør specifikt mesoskala billeddannelse af cellepopulationer, der kan fanges på vigtige tidspunkter såsom opdeling, differentiering og apoptose, men også ved forskellige responstilstande som dem, der induceres af kemisk eksponering for specifikke lægemiddelterapier eller patogene infektioner. Data indsamlet på disse nøglepunkter vil levere 3D-beskrivelse af systemet med en trofast registrering af den rumlige organisering af de forskellige cellulære organeller på disse specifikke øjeblikke.

Normalt anvendes cryo-SXT i kombination med andre teknikker efter korrelative tilgange, der gør det muligt at lokalisere specifikke funktioner, begivenheder eller makromolekyler inden for 3D-cellulære miljø 4,10,11,12,13,14,15,16 eller hårde røntgenfluorescensdata ^17,18 . Korrelative tilgange ved kryogene forhold er af afgørende betydning for at opnå det mest komplette og værdifulde billede af det system, der er af interesse. Et kortfattet resumé af den typiske arbejdsgang på Mistral (Alba) og B24 (Diamond) cryo-SXT strålelinjer er skitseret i figur 1.

Ved at udnytte bølgelængdeindstillingsevnen ved synkrotronfaciliteter kan der desuden opnås spektroskopisk information ud over den strukturelle ved anvendelse af den specifikke differentielle absorption af bestemte elementer indeholdt i prøven. Et eksempel på dette ville være placeringen af calcium i undersøgelsen af biomineraliseringsprocesser i celler 19,20,21. Ved at tage 2D-billeder ved forskellige fotonenergier (spektre) eller tomogrammer nedenfor og ved den røntgenabsorptionskant, der er af interesse, kan pixels eller voxeller, der indeholder det valgte element, identificeres. Spektre tillader også differentiering af kemiske tilstande (dvs. udviklingen af amorft calcium til hydroxyapatit som i det tidligere biomineraliseringseksempel²⁰). Kvantificering af forskellige elementer er mulig i 2D og 3D. Spektroskopisk billeddannelse af forglasede celler udføres typisk i vandvinduet, men er også mulig i andre energiområder, hvis vandindholdet er lavt nok, eller hvis der anvendes andre prøveforberedelsesprotokoller, herunder dehydrering,²². En detaljeret spektroskopi trin-for-trin protokol er uden for protokollens fokus heri.

I det følgende fokuserer protokollen på kort at opsummere de vigtigste prøveforberedelsestrin, selvom hvert system muligvis har brug for individuel forfining, efterfulgt af en detaljeret trin-for-trin dataindsamlingsprocedure for kryo blød røntgentomografi.

Protocol

1. Prøveforberedelse Forberedelse af netunderstøttelsen Bestråle gitterene med UV i 3 timer med carbonfilmen vendt opad til sterilisering. Valgfrit: I tilfælde af problemer med celler, der ikke er fastgjort til gitteret, skal du bruge et af følgende trin. Hydrofilisere kulstofstøttefolien ved plasmabehandling af gitterene for at øge prøvespredningen og bedre celleadhæsion. Placer gitter kulstofsiden op i glødeafladningskammerets udstyr, og udsæt gitteret for plasmaet i 30 s til 15 minutter (ved hjælp af Ar eller / og O2) afhængigt af udstyret. Funktionaliser gitterene med Poly-L-lysin (PLL) Tilsæt individuelle dråber på 60 μL PLL i en petriskål og læg gitteret oven på PLL-dråben med carbonfilmen nedad. Inkuber i 30 minutter ved 37 °C, og blottet PLL ved hjælp af et filterpapir. Funktionaliser gitterene med føtalt kvægserum (FBS). Nedsænk gitterene i FBS natten over. Dyp gitterene i en bufferopløsning for at vaske og lad gitteret stå på et filterpapir for at fjerne overskydende væske. Voksende klæbende celler på gitter Dyrk celler i en cellekulturskål på 100 mm for at nå 80% -90% sammenløb (figur 2A). Frø 1-5 x 105 celler/ml (juster værdi til system) oven på Au-gitterene i en P60 petriskål (3 ml i alt).SEDDEL: Tilsætningen af cellesuspensionen skal udføres meget omhyggeligt med gitterets kulstoffilm vendt opad i en cellekulturskål på 60 mm. Forbered flere gitre pr. tilstand, en betingelse pr. P60 petriskål (figur 2B). Lad cellerne sætte sig, indtil sammenløbet på gitteret når flere celler (1 til 10 afhængigt af cellestørrelsen) i hver maskekvadrkant (afhængigt af cellelinjen kan dette tage op til 24 timer).SEDDEL: Før frysning skal gitterene kontrolleres med et synligt lysmikroskop (VLM), der evaluerer kulstoffilmintegriteten samt cellesammenløbet i hvert gitter (figur 2C). Vent, indtil den korrekte celletæthed på gitteret er nået. Hvis gitteret er for sammenflydende, eller kulstoffolien er brudt, skal du starte forfra. Aflejring af celler i suspension på gitter Vælg et forberedt Au- eller Cu-gitter ved hjælp af pincetten fra stempelfryseren (se pkt. 1.6). Forbered en 1-5 x 10 5-cellesuspension (optisk densitetsabsorberans på 0,3 i tilfælde af bakterier) og tilsæt 4 μL af den forberedte suspension til gitteret. Inkuber gitteret med dråben i få minutter vandret for at muliggøre aflejring af cellerne, og anbring derefter pincetten, der holder gitteret inde i det klimakontrollerede forglasningskammer, der er indstillet til de passende temperatur- og fugtighedsforhold (trin 1.6.1). Valgfrit: fluorescerende mærkning af prøverneSEDDEL: Det kan være en fordel at fluorescerende mærke nogle organeller af prøven. Afhængigt af interessen kan specifikke fluoroforer eller celler, der stabilt udtrykker et fluorescerende protein eller transfekteres til forbigående ekspression af et protein af interesse, anvendes. Dette muliggør nem detektion af celler ved hjælp af kryo-epifluorescensmikroskopi og hjælper med at finde celler af interesse for efterfølgende røntgenbilleddannelse. I det følgende beskriver protokollen kun brugen af fluoroforer. Forbered en arbejdsløsning til fluoroforen (se producentens anbefaling) og følg den specifikke protokol. Tilsæt fluoroforerne til petriskålen, der indeholder gitterene, og bland forsigtigt. Lad det inkubere i et mørkt miljø og gå direkte til trin 1.6, når inkubationen er afsluttet.BEMÆRK: Det er vigtigt at være klar til at forglase, når inkubationen er afsluttet for at undgå uspecifik mærkning og følgelig sløret fluorescerende signal. Au nanopartikler (NPs) forberedelse til justering af tomogramprojektion Tag en alikvote på 1 ml af Au fiducial stamopløsningen (100 nm ved Mistral eller 250 nm ved B24) og centrifugering ved lav hastighed (for at undgå aggregering) i 1 min for at give KN’erne mulighed for at pelletere.SEDDEL: Hvis det er muligt, foretrækkes det at lade fiducials bosætte sig naturligt natten over eller mere for at undgå aggregering. Fjern supernatanten. Umiddelbart inden frysningen suspenderes NP’erne igen i 20 μL serumfri medium eller bufferopløsning for at opnå en homogen opløsning.SEDDEL: Sonikering og hvirvel anbefales at hjælpe med at homogenisere opløsningen. Dyk-frysende gitterFORSIGTIG: Flydende nitrogen kan forårsage kuldeforbrændinger, og der skal bæres korrekt beskyttelsesudstyr (lang laboratoriefrakke, sikkerhedsbriller, handsker, lange bukser og lukkede sko). Ethan er meget eksplosivt og bør holdes væk fra gnister eller åben ild. Følg producentens anvisninger for at forberede og bruge dykfryseinstrumentet.SEDDEL: Fugtigheden er normalt indstillet til 80% -90%; temperaturen afhænger af celletypen (højst gær 30 °C, pattedyrceller 37 °C, insektceller 28 °C osv.). Tag et gitter med monteringspincetten fra petriskålen ved fælgen, og pas meget på ikke at bøje gitteret og montere det på dykkerfryserenheden. Sørg for, at cellerne vender væk fra blottingpapiret. Valgfrit: vask gitteret tre gange i buffer i tilfælde af klæbende celler. Tilsæt 1,5 μL Au NP-fiducials oven på cellerne (gennem hullet på højre side af kammeret) og lad det nøjes med 30 s, før du blotter og kaster gitteret.SEDDEL: I tilfælde af celler i suspension skal du tilføje Au NP-fiducials til gitteret, mens det stadig er i vandret position, før du monterer pincetten, og lad dem slå sig ned i 30 s. Blotting er afgørende for net af høj kvalitet. Blotting afstand skal kalibreres inden start; fladhed af blottingpapir er vigtigt for reproducerbar blotting (følg producentens anvisninger). Blotting tid skal vurderes for hver celletype. Forbered flere gitter pr. Tilstand. Overfør gitteret og opbevar ved kryogene temperaturer for at bevare forglasning. Screeningsgitre med kryomikroskopi af synligt lys Overfør gitterene under flydende nitrogen fra kryokasserne til en standard kryokassette (tre positioner for 3 mm TEM-gitter) inde i et forkølet kryo-trin (se producentens anvisninger). Kryokassetten placeres på kryo-scenebroen, og kryo-stadiet monteres på et bredfeltspifluorescenslysmikroskop. Forestil dig gitterene ved -196,5 °C ved hjælp af et mål for lang arbejdsafstand (10x, 50x, 100x) for at lokalisere egnede celler til kryo-SXT-billeddannelse og vurdere gitterkvaliteten (tilstedeværelse af tyk is, kulstofstøttefilmens integritet, tilstedeværelse af fluorescerende signal osv.). Lokaliser cellerne af interesse ved hjælp af lyse felt eller / og fluorescensbilleddannelse.BEMÆRK: På dette tidspunkt skal du tage billederne, hvis der er et tilknyttet kamera på mikroskopet. Brug det til billedkorrelation. Efter screening skal du returnere gitterene til kryokasserne i en flydende nitrogenlagringsdewar.SEDDEL: Hvis der ikke findes nogen gode prøver, skal du gentage prøveforberedelsestrinnene og ændre en af parametrene. Normalt er de parametre, der kræver modifikation, blotting tid, hvis isen er for tyk eller sammenløbet, hvis der er for mange celler pr. Mesh kvadrat. 2. Indlæsning i transmissionsregenmikroskopet (TXM) Afkøl overføringskammeret med flydende nitrogen, indtil det når <100 K, afkøl arbejdsstationen (figur 3A) og tænd for arbejdsstationens fælg. Vent, indtil det holder op med at koge. Sæt de nødvendige kryokasser med gitre på de tilsvarende steder i arbejdsstationen (figur 3A). Vær opmærksom på sikker overførsel af dem under cryo-forhold. Læg de valgte gitre i de prøveholdere, der tidligere er afkølet (figur 3B); Læg holderne på rumfærgen og beskyt dem med dækslerne (figur 3C). Læg rumfærgen i overføringskammeret ved <100 K, og pump den ned til lavt vakuum (figur 3D). Fastgør overføringskammeret til TXM (figur 4A), og læg rumfærgen fra overføringskammeret ind i TXM efter vakuumproceduren på skærmen (figur 4B). Når rumfærgen er inde med prøverne, kan TXM-robotarmen bringe en prøveholder ad gangen til prøvetrinnet (figur 4C). 3. Billeddannelse ved hjælp af TXM-softwaren BEMÆRK: Gitre i prøvefasen afbildes først ved hjælp af et online synligt lysmikroskop (VLM) for at kortlægge gitteret enten i lysfelt og / eller fluorescenstilstand, før de afbildes med røntgenstråler. Brug joystickikonet, der svarer til fanen Bevægelseskontrol øverst til venstre, til at åbne Bevægelseskontrol. Billeddannelse af nettet med online VLM. Erhvervelse af lys feltmosaik Vælg VLM-kameraet (Forstørrelsesobjektiv > VLM), og tænd VLM-LED-kilden til lysfeltbilleddannelse (Mikroskop > Anskaffelse > Indstillinger for anskaffelse > Kildeindstillinger , og vælg Transmission). Drej prøven til -60 grader for at imødegå VLM-målet (Motion Control > Sample > Sample θ), og flyt prøven til de forventede centrerede positioner (Motion Control > Sample og change Sample X, Sample Y). Mens du først erhverver billeder i trin på 20 til 50 μm for at bringe gitteret nogenlunde i fokus (Mikroskop > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Modes > Continuous > Start; Motion Control > Prøve og ændre Eksempel Z). Finjuler fokus med mindre trin ned til 5 μm, indtil cellerne og/eller hullerne i kulstofstøttefilmen er i fokus (Mikroskop > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Modes > Continuous > Start; Motion Control > Sample and change Sample Z) og start erhvervelsen af et komplet mosaikkort over gitteret i lysfelttilstand. Brug standardværdierne for mosaikken. (Indstillinger for > erhvervelse > anskaffelse > anskaffelsestilstande > Mosaic > Start).SEDDEL: Et mosaikkort er lavet af enkeltbilleder. Antallet af billeder (antal kolonner, rækker og trinstørrelsen i X og Y) skal indstilles til at visualisere hele gitteret. Trinstørrelsen afhænger af størrelsen på synsfeltet (FoV). Standardværdierne bruges her. Hvis gitteret ikke er godt centreret i X-Y-planet med hensyn til den fulde mosaik FoV, skal du stoppe erhvervelsen, rette prøve X- og Y-koordinaterne og gentage erhvervelsen. Fluorescens tilstand mosaik erhvervelse Sluk for VLM-led-kilden til lysfeltsbilleddannelse (Mikroskop > Indstillinger for anskaffelse > Anskaffelse > Kildeindstillinger , og fravælg Transmission), og vælg den LED-lyskilde, der svarer til den ønskede excitationsbølgelængde (rød, grøn eller blå) og det tilsvarende optiske filter manuelt på opsætningen. Forfine fokus på fluorescensbilledet (mikroskop > anskaffelses- > anskaffelsesindstillinger > anskaffelsestilstande > kontinuerlig > start; Motion Control > Sample and Change Sample Z) og derefter erhverve et mosaikkort, der bevarer positionsparametrene (X og Y) fra lysfeltmosaikken (Mikroskop > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Modes > Mosaic > Start). Sluk for LED-lyskilden Valgfrit: Baseret på lyse felt- og fluorescensmosaikkortene skal du kommentere de interesseområder (ROI), der er identificeret tidligere (trin 1.7.4) eller nye ROI (X-Y-positioner i billedet). Erhvervelse af røntgenmosaik Vælg CCD-røntgendetektoren (Forstørrelsesobjektiv > vælg Pixis), bring prøven til 0 graders rotation (Motion Control > Sample and change Sample θ) og flyt røntgenoptikken (kondensator og zoneplade) til de justerede positioner (Motion Control > Condenser > skift kondensator z; Bevægelseskontrol > zoneplade og skift zoneplade Z).SEDDEL: Køl CCD-chippen ned til -65 °C før billeddannelse (mikroskop > Kameratemperatur > Pixis , og skift den indstillede temperatur til -65 °C, og klik på Anvend). Flyt prøven til midten af maskekvadrappet i et af de valgte investeringsafkast (Motion Control > Sample and change Sample X, Sample Y). Brug binning 2 og udgangsspalte ved 5 μm for at minimere bestråling og 1 s eksponering ved Mistral, og binning 1 og 60 μm ved B24, juster fokus ved hjælp af prøve Z-oversættelse (Mikroskop > Acquisition > Acquisition Settings > Camera Settings og skift binning; Motion Control > XS og ændre XS; Indstillinger for anskaffelse > anskaffelse > > anskaffelsesindstillinger> > kontinuerlig >; Motion Control > Prøve og ændre Eksempel Z). Start i trin på 5 μm og finjust det ned til trin på 0,5 μm, indtil cellen eller kulstoffoliehullerne er godt i fokus. Hent et mosaikkort over maskefirkanten (Mikroskop > Indstillinger for anskaffelse > anskaffelse > anskaffelsestilstand > Mosaic > Start). SEDDEL: Parametre for mosaikanskaffelse kan bestemmes på samme måde som for VLM-mosaikkerne (punkt 3.1.1.4). Trinstørrelsen afhænger af den forstørrelse, der er valgt på forhånd af strålelinjepersonalet. Flyt prøven til en FF-position (Flat-Field) (et tomt område i gitteret, helst et hul i kulstofstøtten) (Motion Control > Sample and change Sample X, Sample Y). Indstil eksponeringstiden til 1 s ved Mistral og 0,5 s ved B24 (Mikroskop > Indstillinger for anskaffelse > anskaffelse > Kameraindstillinger og skift eksponeringstid), og hent et enkelt billede (Mikroskop > Anskaffelses- > Anskaffelsestilstande > Enkelt > Start). Normaliser (divider) den erhvervede mosaik af FF-billedet for at opnå transmissionen (med værdier mellem 0 og 1) og gem den normaliserede mosaik (klik på ikonet i første højre øverste hjørne i højre side af billedet for at åbne menuen>vælg fanen Reference> klik på Enkelt reference og gennemse den specifikke FF). Forbereder sig på at indsamle en røntgenhældeserieSEDDEL: Find rotationsaksen for hvert område af interesse, der afbildes.Lav et udvalg af områder i mosaikkerne for at udføre tomografi, dvs. ved at placere en firkantet form (klik på Værktøj i venstre side af billedvinduet) med størrelsen på FoV på røntgenmosaikkortet.SEDDEL: Når du vælger områder, skal du overveje afstanden fra grænsen (≥10 μm) og andre celler for at undgå overlapning af celler under rotation. Kontroller desuden cellens tilstand (forventet celleform, istykkelse, succes med forglasning, fiducial spredning osv.). Prøvejustering på rotationsaksenSEDDEL: Den rapporterede procedure er iterativ. Iterationen konvergerer hurtigere ved hjælp af ± 60° vinkler som maksimale rotationsvinkler (θM). Hvis de ikke er tilgængelige, skal du bruge vinkler så tæt som muligt på ± 60°.Indstil kameraet til binning 2, eksponeringstid 1 s (Mikroskop > Anskaffelse > Indstillinger for anskaffelse > Kameraindstillinger og skift eksponeringstid; skift Binning; Mikroskop > Anskaffelses- > anskaffelsestilstande > Kontinuerlig > Start), indstil udgangsspalte til 5 μm.SEDDEL: Minimer dosis så meget som muligt ved at arbejde med minimal blænde for udgangsslids. Når rotationen er 0 °, skal du flytte til det tidligere valgte område ved hjælp af prøve X og prøve Y-oversættelse og fokusere på cellens funktion for at placere rotationsaksen ved hjælp af prøve Z-oversættelsen (Motion Control > Sample og ændre Sample x; Prøve y; Eksempel z). Drej prøven til + θM (Motion Control > Sample og skift Sample θ) og tegn en linje (L +) (klik på linjeværktøjsknappen i højre side af billedvinduet) på funktionen i cellen for at sætte rotationsaksen på. Drej til -θM (Motion Control > Sample og skift Sample θ) og tegn en linje (L-) (klik på linjeværktøjsknappen i højre side af billedvinduet) på funktionen i den celle, du vil sætte på rotationsaksen. Mens du er på +θM eller -θM, skal du bruge eksempel Z-oversættelse til at flytte den valgte funktion til midterpositionen mellem begge linjer (Bevægelseskontrol > Eksempel og ændre Eksempel Z). Gentag proceduren fra trin 3.3.2.3 iterativt, indtil en minimumsafstand L+ til L- er nået.SEDDEL: Afstanden mellem de to linjer L+ og L- skal være mindre i forhold til den foregående iteration. Ved prøve θ = 0 (Motion Control > Prøve og ændre Prøve θ) skal du flytte prøve X dobbelt så stor afstand, der er nødvendig for at placere den valgte funktion i midten af begge linjer (Motion Control > Sample og ændre Sample X). Flyt Zone Plate (ZP) X for at bringe funktionen tilbage til midten af FoV (Motion Control > ZP og skift ZP X). Gør kun dette trin én gang pr. Gitter. Genoptimer ZP Z-positionen i forhold til den nye rotationsakse ved at optage en ZP Z-fokusserie (samlinger af billeder i forskellige ZP Z-positioner, normalt i trin på 0,3 μm) (Mikroskop > Indstillinger for erhvervelse > > anskaffelsestilstande > Focal Series > Start), og flyt ZP Z til den position, hvor prøven er i fokus (Motion Control > Zone Plate og skift Zone Plate z). Angiv parametrene for anskaffelsen af vippeserien.SEDDEL: Det maksimale vinkelområde er i sidste ende begrænset af ZP’ens brændvidde (±70 eller ±65 grader for henholdsvis 40 nm eller 25 nm ZP for en flad prøve). Optimer signal-støj-forholdet (S/N) og strålingsskader for at definere eksponeringstiden. Til tomografi skal du bruge forskellige eksponeringstider ved forskellige vinkelområder. Bestem det højeste rotationsvinkelområde, hvis skygge opstår, før den maksimale rotationsvinkel er nået. Indstil kamerabinningen til 1 (Mikroskop > Indstillinger for anskaffelse > Anskaffelse > Kameraindstillinger , og skift Binning), åbn udgangsslidsen til 15 μm ved Mistral (Bevægelseskontrol > XS og skift XS), og indstil rotationen til 0° (Bevægelseskontrol > Eksempel og skift Eksempel θ). Anskaf et enkelt billede med en eksponeringstid på 1 s (Mikroskop > Indstillinger for anskaffelse > anskaffelse > anskaffelsestilstande > Enkelt > Start), og anslå den eksponeringstid, der kræves for hver vippevinkel på tomografien. Tomografi erhvervelse Flyt til den negative maksimale vinkel +0,1 (for eksempel for ZP 25 nm gå til -65,1°) (Bevægelseskontrol > Prøve og ændre Prøve θ). Indstil antallet af billeder som det samlede antal vinkler (under hensyntagen til billedet i vinkel 0) og vinkelområdet (Mikroskop > Anskaffelses- > Anskaffelsesindstillinger > Anskaffelsestilstande > Tomografi og skift antallet af billeder; skift derefter Vinkelstart og Vinkelslut). Indstil den definerede eksponeringstid, og start anskaffelsen (Mikroskop > Anskaffelses- > Anskaffelsesindstillinger > Kameraindstillinger, og skift eksponeringstid, og klik derefter på Start). Flyt til FF-positionen (Motion Control > Sample og skift Sample X; skift derefter Sample Y) og hent 10 FF-billeder (Mikroskop > Acquisition > Acquisition Modes > Average og ændre antallet af billeder og derefter klikke på Start).SEDDEL: På Mistral er spektromikroskopi eller energiafhængig mikroskopi mulig, når man erhverver fremskrivninger, mens man scanner energien over en absorptionskant af interesse. Det endelige output er en stak 2D-fremskrivninger, som vil indeholde et røntgenabsorptionsspektrum (XAS) i hver pixel, dvs. billeder med kemisk information. Udvidelse til 3D, der kombinerer spektroskopi med tomografi, er i princippet mulig. Den samlede dosis, der kræves, kan være en begrænsning, og derefter kan der kræves specifikke strategier såsom differentiel absorptionsbilleddannelse. 4. Analyse af data BEMÆRK: Al dataanalyse udføres med tilgængelig åben software og scripts udviklet med automatiserede rørledninger. På Mistral Pipeline konverterer tomografistakke fra txrm-udvidelse (TXM-softwareudvidelse) til hdf5 (open source-hierarkisk dataformat) med alle nødvendige metadata, normaliserer derefter stakken med FF-gennemsnittet og maskinstrømmen og dekonvolverer til sidst stakkene ved hjælp af det optiske systems målte punktspredningsfunktion til en specifik Fresnel zone plate (ZP) linse og energi23, 24. Ved dekonvolution skal du finde den korrekte k = 1 / SNR-værdi (afhænger af prøvetykkelsen). For scriptet udviklet på Mistral skal du skrive kommandoen: txrm2deconv “input tomo” “input FF” -zp = “ZP brugt” – e = ” energi ” – dx = ” pixelstørrelse ” – k = ” 1 / SNR ” – t = -1. For scriptet udviklet på Mistral til automatisk justering skal du skrive kommandoen: ctalignxcorr “normaliseret deconvolved stack.mrc” “normaliseret stack.hdf5”.BEMÆRK: En række softwareapplikationer kan bruges til justering af fremspringene til en fælles rotationsakse ved hjælp af Au NP-fiducials25,26. Justering af fremskrivningerne kræver subpixelnøjagtighed. Automatisk justering kan kun være tilfredsstillende, når Au NP-fiducials er nok (>7) og godt spredt på synsfeltet. Manuel justering er ofte nødvendig efterfølgende for at korrigere automatisk justering for at opnå den højest mulige nøjagtighed. Hvis du vil rekonstruere den justerede normaliserede stak, skal du bruge en af de flere tilgængelige algoritmer.BEMÆRK: Den justerede stak kan rekonstrueres ved hjælp af Weighted Back Projection (WBP) eller Simultaneous Iterative Reconstruction Techniques (SIRT) på få minutter. For at bevare de lineære absorptionskoefficienter (LAC) foretrækkes algebraiske rekonstruktionsteknikker (ART) imidlertid27. ART kræver mere computertid, så SIRT28 udføres først for en hurtig automatisk justeret tilt series-rekonstruktion (30 iterationer på få minutter). Når justeringen er tilfredsstillende, vil ART blive brugt. På B24 En specialbygget pipeline konverterer txrm-datafiler til standard Tiffs med alle de nødvendige metadata og sender dem derefter til en batch runtomo-arbejdsproces, der behandler datasæt på tre måder: WBP, SIRT og patch.

Representative Results

Forberedelse af prøver til cryo-SXT kan være udfordrende. Selv inden for det samme prøvegitter er det muligt at have områder, der er ideelle, og områder, der ikke er ideelle, som det kan ses i figur 5, der viser to firkanter fra det samme Au finder-gitter. Den ideelle prøve skal have enkeltceller i midten af et kvadratisk net, indlejret i et tyndt lag is og omgivet af godt dispergerede Au fiducial markører, der anvendes til justering af vippefremspring før tomografirekonstruktion. Figur 5A viser en fibroblastlignende celle (NIH 3T3), der opfylder mange af disse kriterier. Et enkelt udsnit fra en 3D-rekonstruktion ved hjælp af ART27 af det område, der er markeret med den røde boks, der angiver synsfeltet (FoV), er vist i figur 5B. Mange forskellige organeller såsom mitokondrier (M), endoplasmatisk retikulum (ER), vesikler (V) og kernen (N) kan skelnes takket være den kvantitative rekonstruktion af TAC’erne. Derudover er signal-støj-forholdet mellem rekonstruktionen meget højt, hvilket gør det muligt at opnå høj kontrast mellem de cellulære funktioner. På den anden side viser figur 5C en firkant med højere celletæthed. På grund af dette er blotting normalt mindre effektiv, hvilket fører til et tykkere islag eller endda forglasningsproblemer. I nogle tilfælde kan dette allerede observeres ved screening af nettet ved hjælp af epifluorescenskortlægning forud for røntgenbilleddannelsen, og disse net bør undgås for enhver pris. I figur 5C kan der observeres en revne i gitteret og den glaserede is, der går gennem hele maskefirkanten (markeret med de røde pile). Enhver billeddannelse i nærheden af revner bør undgås på grund af sandsynlig ustabilitet i gitteret, når det udsættes for strålen. Derudover kan revner være et tegn på tyk is, som det var tilfældet i dette område. Der blev optaget en vippeserie i det område, der var markeret med den røde boks. I figur 5D vises et enkelt udsnit fra den tilsvarende 3D-rekonstruktion. Selvom nogle større strukturer kan genkendes, går fine detaljer tabt i støjen og kornet tekstur på grund af den dårlige forglasningskvalitet af den tykke is, som det kan ses specifikt, for eksempel på de øvre mitokondrier, der peges af pilen. Figur 1: Arbejdsgang. Skematisk arbejdsgang fulgt før cryo-SXT dataindsamling. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 2: Voksende celler på gitter. (A) Celler, der vokser i en P100 petriskål med et sammenløb omkring 80% -90%. (B) P60 Petriskål med flere gitre efter såning af cellerne. (C) Celler, der vokser oven på et gitter efter 24 timer. Skalabjælker: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 3: Lastning af gitre på prøveholderne og i overføringskammeret. (A) Arbejdsstation fyldt med flydende nitrogen med rumfærgen og kryokasserne klar til lastning af gitterene. B) Prøveholder indsat i læsseren med gitteret lastet. C) Shuttle med prøveholderen i position 3 uden dæksel. (D) Arbejdsstation med overføringskammeret monteret. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 4: Ilægning af prøver i TXM (A) Fastgørelse af overføringskammeret til TXM. (B) Shuttle inde i TXM. C) TXM-robotarm, der indsætter prøveholderen i prøvefasen. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 5: Eksempel på cryo bløde røntgentomogrammer. Øverste række: ideel prøve, (A) 2D-mosaikvisning af en gitterfirkant, der viser en isoleret celle i midten. (B) Et udsnit fra det rekonstruerede 3D-volumen, der viser det markerede område med den røde boks (A). Sammenlignet med (D) er billedet meget glattere, og flere detaljer er synlige. Nederste række: ikke-ideelle prøver, (C) 2D-mosaikvisning af en gitterfirkant, der viser for høj cellesammenløb og revner i is- og gitterfolien (røde pile). (D) Et udsnit fra det rekonstruerede 3D-volumen, der viser det område, der er markeret med den røde boks i (C). Den dårlige eller suboptimale forglasning kan identificeres ved billedets kornede tekstur. N: Kerne; M: Mitokondrier; ER: Endoplasmatisk retikulum; MV: Multivesikulære legemer; V: Vakuol; Vægtstænger: A & C 20 μm; B & D 2 μm.VKlik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Prøveforberedelse er et kritisk skridt for at opnå bløde røntgentomogrammer af høj kvalitet, da deres kvalitet direkte afhænger af kvaliteten af prøvens forglasning og islagstykkelsen, hvori cellen er indlejret. Fremskrivninger med højt signal-støj-forhold vil blive indsamlet i områder med tyndt islag, hvilket gør det muligt at minimere den strålingsdosis, der kræves for at opnå den højest mulige opløsning. Derudover vil cellesammenløbet også påvirke den endelige tomogramkvalitet, da man bør undgå at have naboceller, der kommer ind i FoV ved rotation. Endelig vil den rigtige spredning af Au fiducial markører bestemme nøjagtigheden af projektionsjusteringen og derefter i sidste ende bestemme kvaliteten af det endelige 3D-rekonstruerede volumen. Bemærk, at en korrekt spredning af Au fiducials på nettet muliggør automatisering af projektionsjusteringstrinnet, uden hvilket der er behov for en høj ekspertise til et så kritisk trin.

Protokollen heri viser kun en mulig prøveforberedelsesstrategi, som har ligheder med dem, der anvendes i kryoelektrontomografi (cryo-ET). I begge tilfælde vil protokoller, der forbedrer den krævende prøveforberedelse for bedre reproducerbarhed, være grundlæggende for succesen med disse teknikker, og der gøres en indsats for at nå dette mål²⁹. Det er værd at nævne, at ud over billeddannelse af isolerede celler kan dele af væv også visualiseres, forudsat at transmissionssignalet gennem sektionen vil være nok ved høje hældningsvinkler. Typisk vil dette indebære sektioner på få mikron (under 10 μm).

For at afbilde en bestemt struktur eller begivenhed inde i en celle skal man sørge for, at denne særlige funktion er inde i FoV i vippeserien. Da FoV i cryo-SXT er begrænset til 10 x 10 μm² til 15 x 15 μm² afhængigt af objektivet og tegner sig for en pixeloversampling af opløsningen til mindst en faktor 2, er den ofte mindre end fuldcelleudvidelsen (se de røde firkanter angivet i figur 5). Derfor skal ROI findes og mærkes korrekt. Dette gøres normalt ved hjælp af fluorescerende tags og synlige lyskorrelative tilgange. 2D-strategier, der kombinerer epifluorescens, er ligetil, da det bløde røntgentransmissionsmikroskop har et integreret online synligt lysfluorescensmikroskop, men andre tilgange til 2D- eller 3D-fluorescenssignal i høj opløsning er også tilgængelige 4,12,13,15,16 . I disse tilfælde skal gitteret først afbildes i specifikke instrumenter såsom superopløsningsmikroskoper. Bemærk, at de mest effektive korrelative tilgange er dem, der involverer dataindsamling under kryogene forhold. Dette skyldes, at tidsforløbet mellem stuetemperatur (RT), synlig lysfluorescensbilleddannelse og prøveglasning for eksempel vil forhindre at fange den rigtige cellulære begivenhed til tiden; Desuden kan forglasningsproceduren fjerne den celle af interesse, der er afbildet på RT, fra gitteret. Selv om de fleste korrelative billeddannelsesmetoder kan indebære, at prøvegitterene skal manipuleres og transporteres fra det ene instrument til det andet, og på trods af den øgede risiko for netforurening eller skade, dette udgør, er belønningen klar: at være i stand til at lokalisere specifikke begivenheder eller molekyler i det cellulære landskab.

Når helcellebilleddannelse er påkrævet, er det muligt at sy forskellige tomogrammer, forudsat at den samlede påførte dosis ikke overstiger strålingsskadegrænsen. Normalt er den deponerede dosis til opsamling af få tomogrammer på den samme celle langt under grænsen ved den opnåelige opløsning (10⁹ Gy), og der kræves derfor ingen specifik strategi for at sænke dosis, selv om denne er prøve- og eksperimentafhængig. I tilfælde af intensiv dataindsamling såsom spektrotomografi ville det faktisk være nødvendigt at minimere dosis, og der ville være behov for praktisk dataindsamling og specifikke behandlingsstrategier.

Cryo-SXT har flere begrænsninger, som bør nævnes her. Den første er den velkendte manglende kile, som er iboende ved at bruge flade prøvestøtter. Kapillærprøvestøtter, der tillader 180 graders rotation, er tidligere blevet brugt og bruges stadig på nogle anlæg, men de præsenterer også ulemper såsom en fattig kontrast på grund af glasabsorptionen og begrænsningen af at bruge celler i suspension. En måde at mindske effekten af den manglende kile på er ved at udføre dobbelt vippetomografi. Dette er faktisk muligt på Mistral beamline i dag. Den anden begrænsning er indstillet af Fresnel zone plade linsen, der anvendes i sådanne mikroskoper. Dette objektiv indstiller den ultimative opløsning, der kan opnås, og dybdeskadslen (DoF), som begge er tæt beslægtede. Dette indebærer, at forøgelse af opløsningen vil mindske DoF, mens cellens tykkelse ofte vil være større. For eksempel vil en 40 nm linse i teorien have en DoF på 3 μm og en opløsning på 24,4 nm halv tonehøjde. Kompromiset mellem opløsning og DoF er derfor strategisk, og valget af linsen afhænger af typen af cellen^30,31. Endelig er operationelle TXM’er over hele verden langt fra at være ideelle mikroskoper, og der gøres en indsats for at forbedre de optiske systemer for at nå de teoretiske forventninger. Endelig kan visualisering og segmentering af de rekonstruerede volumener udføres med specifikke softwareværktøjer 25,32,33,34.

Sammenfattende tillader cryo-SXT billeddannelse af celler kvantitativt ved medium opløsning (25-30 nm halv tonehøjde) og i statistiske tal (få titalls tomogrammer pr. Dag). Dette gør det muligt at opnå organisering, distribution og dimension af organeller under specifikke forhold, for eksempel under patogeninfektion eller sygdomme, på præcise tidspunkter eller efter bestemte behandlinger. Det er derfor en nyttig komplementær biologisk billeddannelsesteknik til de mere almindelige elektron- og synlige lysmikroskopier, der hver især tackler et specifikt udvalg af prøvedimensioner og opløsning. Cryo-SXT anvendes ofte i korrelative tilgange, der involverer fluorescens i synligt lys, men andre cryo korrelative strategier er også mulige.

Materials

Amira	Thermo Fisher		Software for segmentation
Au Holey Carbon Films  finder grids	(Quantifoil Micro Tools Gmb	R 2/2 Au G200F1	Au Holey Carbon Films finder grids
Au nanoparticles	BBI Group, Cardiff, UK	Au nanoparticles 100nm	100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba)
Au nanoparticles	BBI Group, Cardiff, UK	Au nanoparticles 250nm	250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond)
Axio Scope A1	Zeiss	430035 9060	Fluorescence microscope
Blotting No.1 filter paper	Whatman	WHA10010155	Blotting filter
Bsoft			Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008)
Chimera			Software for segmentation (Pettersen et al. 2004)
Cryo-EM Glow Discharge Set	PELCO easiGlow	91000S	Glow Discharge Cleaning System
Cu Holey Carbon Films  finder grids	(Quantifoil Micro Tools Gmb	R 2/2Cu G200F1	Cu Holey Carbon Films finder grids
Fetal calf serum	Sigma	F9665	Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture
ImageJ			Software for image processing and analysis in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin)
IMOD			Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996)
Leica EM GP Grid Plunger	Leica	16706401	Automatic Plunge Freezer EM
LINKAM cryo-stage	Linkam Scientific Instruments	CMS 196	Cryo-Correlative Microscopy Stage
MIB			Software for segmentation (Belevich et al. 2016)
P100 Petri dish	Sigma	P6106	Treated for cell culture and sterile
P60 Petri dish	Sigma	D8054	Treated for cell culture and sterile
Polylysin	Sigma	P4707	Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered
Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV	Xradia	NCT-SB	Transmission soft X-Ray microscope
SURVOS			Software for segmentation  (Luengo et al. 2017)
Tomo3d			Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011)
TomoJ			Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007)
XM Data Explorer	Zeiss		TXM software