Medicine

使用氟磷钙标签和纳米粒子跟踪分析估计人类泌尿纳米晶体

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62192

Parveen Kumar¹, Andrew Bell¹, Tanecia Mitchell¹

¹Department of Urology, University of Alabama at Birmingham

Summary

这项研究的目的是确定纳米粒子跟踪分析（NTA）能否检测和量化含有健康成年人纳米晶体的尿钙。目前的研究结果表明，NTA可能是估计肾结石疾病期间泌尿纳米晶体的潜在工具。

Abstract

肾结石在全世界成人和儿童中越来越普遍。最常见的肾结石类型由草酸钙（CaOx）晶体组成。当尿液中富含矿物质（如钙、草酸盐、磷酸盐）并形成肾结石之前时，就会发生结晶。评估石器晶体的标准方法包括显微镜、过滤和离心。然而，这些方法主要检测微晶体，而不是纳米晶体。纳米晶体被建议对肾脏上皮细胞的危害大于体外微晶体。在这里，我们描述了纳米粒子跟踪分析（NTA）检测人类泌尿纳米晶体的能力。健康成年人在饮用草酸盐负荷以刺激泌尿纳米晶体之前，先吃受控的草酸盐饮食。尿在草酸盐负荷前后收集了24小时。用乙醇加工和清洗样品以净化样品。泌尿纳米晶体沾染了钙结合氟磷，氟-4 AM。染色后，使用 NTA 确定纳米晶体的大小和计数。这项研究的结果表明，NTA可以有效地检测健康成年人的纳米晶体。这些发现表明，NTA可能是肾结石患者纳米晶体的有价值的早期检测方法。

Introduction

当尿液中富含矿物质时，尿晶体就会形成。这可能发生在健康的人，但更常见的个人肾结石^1。泌尿晶体的存在和积累会增加患肾结石的风险。具体来说，当晶体与兰德尔的斑块结合，核化，积累，并随着时间的推移生长^2，3，4时^，就会发生这种情况。晶体在肾结石形成之前和晶体的评估可能具有预测价值的肾结石前^3，5。具体来说，结晶体已被建议有用，以预测在含有结石^6，7的草酸钙病史患者的结石复发的风险。

据报道，晶体对肾上皮和循环免疫细胞功能^{8、9、10、11、12、13}产生负面影响。此前有报道称，与健康个体^相比，从草酸钙（CaOx）肾结石前体中循环的单核细胞抑制了细胞生物能学。此外，CaOx晶体可减少细胞生物能学，并破坏单核细胞⁸中的红氧平衡。食用富含草酸盐的膳食可能导致结晶体，导致肾管损伤，并改变保护肾结石形成^的尿大分子的生产和^功能。多项研究已证明，尿晶体的形状和大小可能因尿液^17、18、19的pH值和温度而异。此外，尿蛋白已被证明可以调节晶体行为^20。道登等人¹⁹日提出，结晶体分析可能有助于肾结石病患者的管理，并评估他们对治疗的反应。目前可用于评估晶体存在的一些常规方法包括极化显微镜^21、22、电子显微镜^23、粒子计数器^3、尿液过滤^24、蒸发^3、5或离心^21。这些研究为肾结石领域提供了宝贵的见解。然而，这些方法的局限性是无法可视化和量化大小小于 1μm 的晶体。这种大小的晶体可能通过附着在兰德尔的斑块上来影响CaOx石的生长。

与较大的微晶体²⁵相比，纳米晶体已证明对肾脏细胞造成广泛损伤。纳米晶体的存在已经报告在尿液中使用纳米粒子分析仪^26，27。最近的研究已经使用荧光标记的双磷酸盐探针（亚龙-氟辛/阿伦德龙酸盐-Cy5）来检查纳米晶体使用纳米级流细胞测量^28。这种染料的限制是，它不是具体的，将结合几乎所有类型的石头，除了半胱氨酸。因此，准确评估个体中纳米晶体的存在可能是诊断结晶体和/或预测结石风险的有效工具。本研究的目的是利用纳米粒子跟踪分析（NTA）检测和量化含有纳米晶体的钙（大小为 <1微米）。为此，NTA 技术与含钙氟磷、氟-4 AM 相结合，用于检测和量化健康成年人尿液中含有纳米晶体的钙。

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Protocol

这项工作中概述的所有实验都得到了阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）机构审查委员会的批准。健康成人（33.6±3.3岁;n=10）如果有正常的血液综合代谢板，非烟草使用者，非怀孕，体重指数在20-30公斤^/米2之间，并且没有慢性疾病或急性疾病，则报名参加研究。健康参与者在研究开始前签署了书面知情同意书。

1. 临床协议和尿液收集

让参与者在收集尿液（24 小时样本）之前，先食用由 UAB 临床和转化科学中心准备的低草酸盐饮食 3 天，并快速过夜。
第二天，让参与者在食用草酸盐（含有水果和蔬菜的冰沙，约8毫米草酸盐）之前返回其24小时尿样（草本前）。参与者随后收集尿液24小时（牛酸后样本），第二天返回尿液。
在处理前在室温下保持所有尿液样本（RT），如下图 1所示。

2. 尿液处理

注：所有使用的材料和设备都列在 材料表中。
注意：在处理临床样品和试剂时，时刻佩戴个人防护装备。具体来说，手套、脸部和眼罩、呼吸保护和防护服。

测量和记录尿液pH度和体积。在将 50 mL 尿液添加到标记的无菌 50 mL 圆锥管中之前，彻底混合。
使用台式离心机在 RT 中以 1200 x g 的离心机样品 10 分钟。
注意：将样品保存在RT，以防止进一步的晶体形成，因为较冷的温度可以促进结晶。
丢弃超自然物，用5mL的100%乙醇再次清洗和补充颗粒。使用台式离心机在 RT 将样品以 1200 x g 分分钟，使用离心机进行 10 分钟。
丢弃超自然物，在1mL的100%乙醇中补充颗粒。将样品储存在 -20 °C，以供以后处理或弄脏样品，如下所述。
注意：存储或新鲜染色样品的数据点（即颗粒大小/浓度）没有显著差异。

3. 纳米粒子跟踪分析

样品准备
1. 金纳米粒子：使用金纳米粒子优化仪器上的设置。在超纯水中稀释 100 nm 大小的金纳米粒子 1：1000。
2. 人类尿液：在水中稀释尿液样本20次，然后用5mM Fluo-4 AM（一种钙荧光染料）在黑暗中染色30分钟。使用 NTA 分析样本。
3. 准备氧化钙（CaOx）晶体，如前所述^29。在分析之前，将 10 mM 库存溶液（10 mL 水中的 14.6 毫克）稀释到 50 μM，并在黑暗中使用 5 mM Fluo-4 AM 对稀释样品进行污渍 30 分钟。
4. 磷酸钙（CaP）晶体：在 NTA 分析之前，在水中稀释 10 mM 库存溶液（10mL 水中 50.4 毫克）至 50 μM，并在黑暗中使用 5 mM Fluo-4 AM 对稀释样品进行污渍 30 分钟。
仪器设置、摄像机设置和数据收集
注：用于此方法的计算机和仪器设置显示在 图 2 中。
1. 打开电脑，然后打开仪器。打开软件并打开相机。
2. 打开软件窗口后，单击窗口左上角的捕获图标以启动捕获模式。相机初始化需要几秒钟。
3. 首先使用 1 mL 注射器将空气泵入平台，直到平台看起来清洁。使用另一个 1 mL 注射器将水轻轻加入仪器 2-3 次，以消除任何气泡。
  注意：在平台和管道中查找任何气泡。在运行样品之前和运行样品时，在整个仪器中不要有气泡是很重要的。如果存在气泡，用空气和水再次清洁平台。
4. 平台清洁后，通过查看摄像机添加水以检查表面是否有污染。接下来，在样品装载泵喷油器中加入金纳米粒子作为控制，以设置仪器。
5. 将屏幕上或旋钮上的摄像头级别调整到仪器的右侧，直到图像开始显示彩色像素，然后降低相机水平。
6. 然后调整屏幕以优化图像。左键单击视频图像上的鼠标按钮。按住左鼠标按钮，上下拖动图像以获取整个视图。
  注：普通相机镜头和滤镜用于评估金纳米粒子和未染色样品。
7. 设置输液速度并对焦相机，使金纳米粒子在相机屏幕上可见。将输液速度设置为高（即 500 μL/min），以便初始设置，以确保检测到金纳米粒子。检测到后，将速度降低到 50μL/min。
8. 调整相机水平以可视化粒子。对于未染色的样品，调整 5 级的屏幕增益以实现相机对焦，并将相机级别设置为 8。设定对焦后，记录示例（即仅 1 次测量，仅 60 秒）。
  注：对焦和连续流速对于获取清晰清晰的粒子图像以进行计数非常重要。
9. 优化后，在评估样品之前，再次用水清洁设备。查看摄像机，确保管子清洁且颗粒不存在。
  注意：在每个样品之间清洗腔室，直到摄像机检测到颗粒。
10. 要分析染色样品，将相机调整到包含合适荧光滤光片的滤镜位置。将稀释和染色的样品加载到样品装载泵喷油器上，并将速度降低到 20 μL/min，以便分析样品。
11. 接下来调整屏幕增益和相机级别，因为这些是重要的参数。对于染色（荧光）样品，将屏幕增益设置为 5，相机级别设置为 13 级。
  注意：这些参数将根据样本类型而变化，每个示例都需要优化以获得焦点。
12. 使用标准测量来测量每个样本的 5 次捕获，其中一个捕获持续时间为 60 秒。
13. 每次测量后保存和存储数据。该软件将为每个测量保存图像和视频文件。该软件提供输出数据（例如，晶体大小：10 nM - 1000 nM 和浓度）在卓越和 pdf 格式。
14. 计算每个样本所有 5 个读数的平均纳米粒子数。使用平均值的标准偏差或标准误差分析数据，并使用 t 测试进行配对分析。

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Representative Results

这项研究的结果表明，NTA可以有效地检测人类尿液中含有尿纳米晶体的钙的平均大小和浓度。这是通过使用氟磷、氟-4 AM 和纳米粒子跟踪分析实现的。Fluo-4 AM 能够与 CaOx 和 CaP 晶体结合。如图3A所示，CaOx晶体的大小确定在50-270纳米之间，平均浓度为1.26 x 10⁹颗粒/mL。CaP晶体的大小在30-225纳米之间，平均浓度为2.22×10⁹粒子/mL（图3B）。为了确定NTA能否评估人类尿液中的纳米晶体，健康成年人被要求食用受控的草酸盐饮食，然后摄入高草酸盐。收集负荷前后的24小时尿液样本，以评估尿纳米晶体大小和浓度。草前尿液样本中含有一些尿纳米晶体（1.65 x 10⁸ ± 3.29 x 10⁷颗粒/mL）在 110-300 nm 之间（图 4）。相比之下，氧化后样品（7.05 x 10^8< ±1.08 x 10 8 粒子/mL;100-320 nm）尿纳米晶体显著增加（p.010001）。为了确认该方法的可重复性，对样品进行了三次测量，技术复制品（图5）没有显著变化。

图1：隔离和染色人类泌尿纳米晶体的协议。请点击这里查看此图的更大版本。

图2：纳米粒子跟踪分析（NTA）的描述。 （B）样品在填充光学表面之前，使用注射器泵以连续速度注入进水管。然后，通过目标镜头观察样品，当样品流过平台时，相机会捕获样品，然后通过出口管退出以丢弃样品。请单击此处查看此图的较大版本。

图3： NTA 检测 Fluo-4 AM 标记的草酸钙（CaOx）和磷酸钙（CaP）晶体。（A） CaOx 和（B）CaP 晶体的代表图显示大小分布和浓度。请单击此处查看此图的较大版本。

图4：NTA检测Flo-4 AM标记为24小时人类泌尿纳米晶体。 Fluo-4 AM 代表图在 24 小时牛皮前和牛后样本中标记了尿纳米晶体，这些样本来自健康成年人，使用受控的草酸盐饮食。请单击此处查看此图的较大版本。

图5：使用NTA在24小时尿液收集中复制人类纳米晶体的技术。 在24小时（A）牛酸前和（B）牛酸盐后从健康成年人的受控草酸盐饮食中，对Fluo-4 AM标记的泌尿纳米晶体进行技术复制。请单击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

NTA在本研究中使用钙结合探针Flo-4 AM来评估人类尿液中的纳米晶体。没有标准方法可以检测尿液中的纳米晶体。一些研究小组已经检测出尿液中的纳米晶体，并依靠使用广泛的协议或方法，这些协议或方法限制了他们量化样本^的能力^。这项研究展示了一种特定而敏感的方法，用于检测参与饮食喂养研究的人类尿液中含有纳米晶体的钙，该研究包括摄入高草酸盐负荷。草酸盐的消耗量相当于实际世界中草酸盐的消耗量（例如，1/2菠菜沙拉）。

NTA是一种具有良好特征的高分辨率工具，它使用布朗运动测量解决方案³⁰中的粒子。它已用于评估生物纳米粒子的各种生物样本^{31，32，33。}此外，NTA 可以准确预测任何类型的生物样本中颗粒的大小和浓度。此方法不需要任何标签：但是，标签可用于检测特定颗粒。在这项研究中，利用Flo-4 AM高效和专门地检测尿液样本中含有纳米晶体的钙。钙荧光探针最初用于测量自由细胞酸钙^34。Fluo-4是荧光-3的类似物，其荧光在与³⁵自由钙结合后增加>100倍。此外，Fluo-4已被证明使用流细胞^学36来评估关节炎患者的同体液中的钙颗粒。因此，我们使用 Fluo-4 AM 进行这些研究。

所有样品均不断注入平台进行精确检测。确定浓度和颗粒大小取决于流速，因为高流速率（即 50 μL/min）会影响对浓度的准确评估，以及粒子大小与静态设置和较低流速（即 20 μL/min）37 相比。因此，稳定的慢速流速可准确测量样品中存在的颗粒数量。其他可能影响粒子计数和大小的重要参数包括相机水平、检测阈值和对焦 38、39、40。样品中一致的粒子测量（CV 约 20%）在目前的研究中观察到，这与另一项研究³⁹的发现是一致的。最后，使用电子显微镜²⁹证实人类尿液中存在纳米晶体。这项研究证明NTA可以成功地测量来自人类的尿纳米晶体。

此协议的一个优点是使用 Fluo-4 AM 来评估溶液中含有颗粒的钙。另一个优点是在检测样品中的纳米晶体时观察到的最小变异性。NTA在此设置中的一个限制是无法区分纳米晶体的形态。然而，这种方法可能有利于检测结晶体，以预测有含肾结石钙病史的个人的结石风险。此协议无法取代当前的方法，但可能会提供有关泌尿纳米晶体的新见解。使用NTA来评估含晶体的尿钙是一种新方法，它应该强调纳米晶体的重要性，超越标准显微镜和上述方法。有必要进行更多的调查，以探索这种方法在肾结石人群中的可靠性。

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Disclosures

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgments

作者感谢所有研究参与者和 UAB CCTS 生物营养核心和 UAB 高分辨率成像服务中心的贡献。这项工作得到了国家卫生研究院DK106284和DK123542（TM）和UL1TR003096（国家推进转化科学中心）的支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benchtop Centrifuge	Jouan Centrifuge	CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate	Synthesized in the lab as previously described²⁹.		Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder)	Sigma	677418	Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol	Fischer Scientific	AC615095000	Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM*	AAT Bioquest, Inc.	20550	Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles	Sigma	742031	Store at 2-8°C
NanoSight Instrument	Malvern Instruments, UK	NS300
Syringe pump	Harvard Apparatus	98-4730
Virkon Disinfectant	LanXESS Energizing Company, Germany	LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.