Vurdering af urin nanokrystaller hos mennesker ved hjælp af calcium fluorophor mærkning og nanopartikel tracking analyse
Summary
Formålet med denne undersøgelse var at afgøre, om nanopartikelsporingsanalyse (NTA) kunne påvise og kvantificere calciumholdige nanokrystaller i urinen fra raske voksne. Resultaterne fra den nuværende undersøgelse tyder på NTA kunne være et potentielt redskab til at estimere urin nanokrystaller under nyresten sygdom.
Abstract
Nyresten bliver mere udbredt på verdensplan hos voksne og børn. Den mest almindelige type nyresten består af calciumoxalat (CaOx) krystaller. Crystalluria opstår, når urinen bliver overmættet med mineraler (f.eks. calcium, oxalat, fosfat) og går forud for nyrestensdannelse. Standardmetoder til vurdering af krystallutri i stenformer omfatter mikroskopi, filtrering og centrifugering. Men disse metoder primært opdage mikrokrystaller og ikke nanokrystaller. Nanokrystaller er blevet foreslået at være mere skadelige for nyre epitelceller end mikrokrystaller in vitro. Her beskriver vi nanopartikelsporingsanalysens (NTA) evne til at detektere humane nanokrystaller i urinen. Raske voksne blev fodret med en kontrolleret oxalat kost før du drikker en oxalat belastning for at stimulere urin nanokrystaller. Urin blev indsamlet i 24 timer før og efter oxalatbelastningen. Prøverne blev behandlet og vasket med ethanol for at rense prøver. Urin nanokrystaller blev plettet med calcium bindende fluorophore, Fluo-4 AM. Efter farvning blev størrelsen og antallet af nanokrystaller bestemt ved hjælp af NTA. Resultaterne fra denne undersøgelse viser, at NTA effektivt kan detektere nanokrystallutri hos raske voksne. Disse fund tyder på, at NTA kan være en værdifuld metode til tidlig påvisning af nanokrystallutri hos patienter med nyrestenssygdom.
Introduction
Urinkrystaller form, når urinen bliver overmættet med mineraler. Dette kan forekomme hos raske personer, men er mere almindeligt hos personer med nyresten1. Tilstedeværelsen og akkumuleringen af urinkrystaller kan øge ens risiko for at udvikle en nyresten. Specifikt sker dette, når krystaller binder sig til Randalls plak, kerne, akkumuleres og vokser over tid2,3,4. Crystalluria går forud for nyresten dannelse og vurdering af crystalluria kan have prædiktiv værdi i nyresten tidligere3,5. Konkret er krystalluria blevet foreslået at være nyttig til at forudsige risikoen for sten gentagelse hos patienter med en historie af calciumoxalat indeholdende sten6,7.
Krystaller er blevet rapporteret til negativ indvirkning nyre epitel og cirkulerende immuncellefunktion8,9,10,11,12,13. Det er tidligere blevet rapporteret, at cirkulerende monocytter fra calciumoxalat (CaOx) nyrestens tidligere har undertrykt cellulære bioenergetics sammenlignet med raske personer14. Derudover reducerer CaOx-krystaller cellulære bioenergetics og forstyrrer redox homeostase i monocytter8. Indtagelse af måltider rig på oxalat kan forårsage krystalluri, som kan føre til nyre tubule skader og ændre produktionen og funktionen af urin makromolekyler, der beskytter mod nyrestendannelse 15,16. Flere undersøgelser har vist, at urinkrystaller kan variere i form og størrelse afhængigt af pH og temperaturen i urinen17,18,19. Desuden har urinproteiner vist sig at modulere krystaladfærd20. Daudon et al.19, foreslog, at crystalluria analyse kunne være nyttige i forvaltningen af patienter med nyresten sygdom og i vurderingen af deres reaktion på behandlinger. Et par konventionelle metoder, der i øjeblikket er tilgængelige til at evaluere tilstedeværelsen af krystaller, omfatter polariseret mikroskopi21,22, elektronmikroskopi23, partikeltællere3, urinfiltrering24, fordampning3,5 eller centrifugering21. Disse undersøgelser har givet værdifuld indsigt i nyresten feltet om krystalluri. En begrænsning af disse metoder har imidlertid været den manglende evne til at visualisere og kvantificere krystaller under 1 μm i størrelse. Krystaller af denne størrelse kan påvirke væksten af CaOx sten ved at knytte til Randall’s plak.
Nanokrystaller har vist sig at forårsage omfattende skade på nyreceller sammenlignet med større mikrokrystaller25. Tilstedeværelsen af nanokrystaller er blevet rapporteret i urinen ved hjælp af en nanopartikelanalysator26,27. Nylige undersøgelser har anvendt fluorescerende mærkede bisfosfatsonder (alendronat-fluorescein/alendronat-Cy5) til at undersøge nanokrystaller ved hjælp af nanoskala flow cytometry28. Begrænsningen af dette farvestof er, at det ikke er specifikt og vil binde sig til næsten alle typer sten undtagen cystein. En nøjagtig vurdering af tilstedeværelsen af nanokrystaller hos enkeltpersoner kan således være et effektivt redskab til at diagnosticere krystallutri og/eller forudsige stenrisiko. Formålet med denne undersøgelse var at påvise og kvantificere calciumholdige nanokrystaller (< 1 μm i størrelse) ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse (NTA). For at opnå dette blev NTA-teknologi brugt i kombination med en calciumbinding fluorophore, Fluo-4 AM til at detektere og kvantificere calcium indeholdende nanokrystaller i urinen hos raske voksne.
Protocol
Representative Results
Discussion
NTA er blevet brugt i denne undersøgelse til at vurdere nanokrystaller i human urin ved hjælp af en calciumbindingssonde, Fluo-4 AM. Der findes ingen standardmetode til påvisning af nanokrystaller i urinen. Nogle forskergrupper har opdaget nanokrystaller i urinen og påberåbt sig brugen af omfattende protokoller eller metoder, der er begrænset i deres evne til at kvantificere prøverne27,28. Denne undersøgelse viser en specifik og følsom metode til påvisn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker alle deltagere i undersøgelsen og UAB CCTS Bionutrition Core og UAB High Resolution Imaging Service Center for deres bidrag. Dette arbejde blev støttet af NIH grants DK106284 og DK123542 (TM) og UL1TR003096 (National Center for Advancing Translational Sciences).
Materials
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. | |||
References
- Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
- Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall’s plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
- Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
- Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
- Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone “activity”. British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
- Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
- Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
- Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
- Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
- Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
- Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
- Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
- Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
- Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
- Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
- Khan, S. R., Kok, D. J. Modulators of urinary stone formation. Frontiers in Bioscience. 9, 1450-1482 (2004).
- Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
- Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
- Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, 624-632 (2016).
- Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
- Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
- Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. . Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , 261-263 (2001).
- Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H. Crystalluria. Journal of Crystal Growth. 53 (1), 166-181 (1981).
- Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
- Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).
- He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
- Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).
- Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328 (2016).
- Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
- Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research–A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
- Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
- Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).
- Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson’s disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).
