L’obiettivo di questo studio era determinare se l’analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) potesse rilevare e quantificare il calcio urinario contenente nanocristalli di adulti sani. I risultati dell’attuale studio suggeriscono che l’NTA potrebbe essere un potenziale strumento per stimare i nanocristalli urinari durante la malattia da calcoli renali.
I calcoli renali stanno diventando sempre più diffusi in tutto il mondo negli adulti e nei bambini. Il tipo più comune di calcoli renali è costituito da cristalli di ossalato di calcio (CaOx). I cristalli si verificano quando l’urina diventa supersatura di minerali (ad esempio calcio, ossalato, fosfato) e precede la formazione di calcoli renali. I metodi standard per valutare i cristalli nei formatori di pietra includono microscopia, filtrazione e centrifugazione. Tuttavia, questi metodi rilevano principalmente microcristalli e non nanocristalli. I nanocristalli sono stati suggeriti per essere più dannosi per le cellule epiteliali renali rispetto ai microcristalli in vitro. Qui descriviamo la capacità dell’analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) di rilevare i nanocristalli urinari umani. Gli adulti sani sono stati nutriti con una dieta ossalata controllata prima di bere un carico ossalato per stimolare i nanocristalli urinari. L’urina è stata raccolta per 24 ore prima e dopo il carico di ossalato. I campioni sono stati lavorati e lavati con etanolo per purificare i campioni. I nanocristalli urinari erano macchiati con il fluorofoforo legante il calcio, Fluo-4 AM. Dopo la colorazione, le dimensioni e il conteggio dei nanocristalli sono stati determinati usando l’NTA. I risultati di questo studio mostrano che NTA è in grado di rilevare in modo efficiente la nanocristalluria negli adulti sani. Questi risultati suggeriscono che l’NTA potrebbe essere un prezioso metodo di diagnosi precoce della nanocristalluria nei pazienti con malattia da calcoli renali.
I cristalli urinari si formano quando l’urina diventa supersatura di minerali. Questo può verificarsi in individui sani ma è più comune negli individui con calcoli renali1. La presenza e l’accumulo di cristalli urinari può aumentare il rischio di sviluppare un calcolo renale. In particolare, ciò si verifica quando i cristalli si legano alla placca di Randall, nucleato, si accumulano e crescono neltempo 2,3,4. Crystalluria precede la formazione di calcoli renali e la valutazione dei cristalli può avere un valore predittivo nei calcoli renaliex 3,5. Nello specifico, è stato suggerito che i cristalli siano utili per prevedere il rischio di recidiva della pietra in pazienti con una storia di ossalato di calcio contenentepietre 6,7.
È stato riferito che i cristalli hanno un impatto negativo sulla funzione epiteliale renale e sulle cellule immunitariecircolanti 8,9,10,11,12,13. È stato precedentemente riferito che i monociti circolanti da ex calcoli renali di ossalato di calcio (CaOx) hanno soppresso la bioenergetica cellulare rispetto agli individui sani14. Inoltre, i cristalli caOx riducono i bioenergetici cellulari e interrompono l’omeostasi redox nei monociti8. Il consumo di pasti ricchi di ossalato può causare cristalli che potrebbero causare danni tubuli renali e alterare la produzione e la funzione di macromolecole urinarie protettive contro la formazione di calcolirenali 15,16. Diversi studi hanno dimostrato che i cristalli urinari possono variare per forma e dimensioni a seconda del pH e della temperatura delle urine17,18,19. Inoltre, le proteine urinarie hanno dimostrato di modulare il comportamento cristallino20. Daudonet al. Alcuni metodi convenzionali attualmente disponibili per valutare la presenza di cristalli includono microscopia polarizzata21,22,microscopia elettronica23,contatori di particelle3,filtrazione delle urine24,evaporazione3,5 o centrifugazione21. Questi studi hanno fornito preziose informazioni sul campo di calcoli renali per quanto riguarda i cristalli. Tuttavia, una limitazione di questi metodi è stata l’incapacità di visualizzare e quantificare cristalli di dimensioni inferiori a 1 μm. Cristalli di queste dimensioni possono influenzare la crescita delle pietre CaOx attaccandosi alla placca di Randall.
È stato dimostrato che i nanocristalli causano lesioni estese alle cellule renali rispetto ai microcristalli più grandi25. La presenza di nanocristalli è stata segnalata nelle urine utilizzando un analizzatore di nanoparticelle26,27. Recenti studi hanno utilizzato sonde bisfosfato etichettate fluorescentmente (alendronato-fluoresceina/alendronato-Cy5) per esaminare i nanocristalli usando citometria a flusso su scala nanometrica28. La limitazione di questo colorante è che non è specifico e si legherà a quasi tutti i tipi di pietre tranne la cisteina. Pertanto, valutare con precisione la presenza di nanocristalli negli individui può essere uno strumento efficace per diagnosticare i cristalli e / o prevedere il rischio di pietra. Lo scopo di questo studio era quello di rilevare e quantificare il calcio contenente nanocristalli (<1 μm di dimensioni) utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Per raggiungere questo obiettivo, la tecnologia NTA è stata utilizzata in combinazione con un fluorofore legante il calcio, Fluo-4 AM per rilevare e quantificare il calcio contenente nanocristalli nelle urine di adulti sani.
L’NTA è stata utilizzata nel presente studio per valutare i nanocristalli nelle urine umane utilizzando una sonda legante il calcio, Fluo-4 AM. Non esiste un metodo standard disponibile per rilevare i nanocristalli nelle urine. Alcuni gruppi di ricerca hanno rilevato nanocristalli nelle urine e si sono affidati all’uso di ampi protocolli o metodi che sono limitati nella loro capacità di quantificarei campioni 27,28. Questo studio mostra un metodo specifico e se…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano tutti i partecipanti allo studio e l’UAB CCTS Bionutrition Core e uab High Resolution Imaging Service Center per i loro contributi. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH DK106284 e DK123542 (TM) e UL1TR003096 (Centro nazionale per l’avanzamento delle scienze traslazionali).
Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |