Summary
本研究の目的は、ナノ粒子追跡解析(NTA)が健康な成人からのナノ結晶を含む尿中カルシウムを検出し、定量化できるかどうかを決定することであった。現在の研究結果は、NTAが腎臓結石疾患中の尿ナノ結晶を推定する潜在的なツールである可能性を示唆している。
Abstract
腎臓結石は、大人と子供の世界的に一般的になってきています。最も一般的なタイプの腎臓結石は、シュウ酸カルシウム(CaOx)結晶で構成されています。結晶尿は、尿がミネラル(例えば、カルシウム、シュウ酸塩、リン酸塩)で過飽和になると発生し、腎臓結石形成の前に起こる。石のフォーマーの結晶を評価する標準的な方法には、顕微鏡、ろ過、遠心分離が含まれます。しかし、これらの方法は、主にナノ結晶ではなく微小結晶を検出する。ナノ結晶は、インビトロの微結晶よりも腎臓上皮細胞に有害であることが示唆されている。ここでは、ナノ粒子追跡解析(NTA)がヒトの尿中ナノ結晶を検出する能力について述べる。健康な成人は、尿中ナノ結晶を刺激するためにシュウ酸塩負荷を飲む前に、制御されたシュウ酸食を与えられた。尿はシュウ酸負荷の前後に24時間採取した。試料を処理し、エタノールで洗浄し、試料を精製した。尿中ナノ結晶をカルシウム結合蛍光色素で染色し、フルオ-4 AM.染色後、ナノ結晶のサイズと数はNTAを用いて決定した。この研究結果から、NTAは健康な成人のナノ結晶を効率的に検出できることを示している。これらの知見は、NTAが腎臓結石症患者におけるナノ結晶の貴重な早期発見方法である可能性を示唆している。
Introduction
尿結晶は、尿がミネラルで過飽和になると形成されます。これは健康な個体で起こり得るが、腎臓結石1を有する個人でより一般的である。尿結晶の存在と蓄積は、腎臓結石を発症するリスクを高めることができます。具体的には、これは、結晶がランドールのプラークに結合し、核を持ち、蓄積し、時間2、3、4の間に成長するときに起こる。結晶は、腎臓結石の形成と結晶の評価に先行して、腎臓結石形成体3,5に予測値を有する可能性がある。具体的には、結晶が石6,7を含むシュウ酸カルシウムの既往歴を有する患者において石の再発のリスクを予測するのに有用であることが示唆されている。
結晶は、腎上皮および循環免疫細胞機能8、9、10、11、12、13に悪影響を及ぼすと報告されている。シュウ酸カルシウム(CaOx)腎臓結石のフォーマーからの循環単球が、健康な個体14と比較して細胞バイオエネルギーを抑制していることが以前に報告されている。さらに、CaOx結晶は、細胞の生体エネルギーを減少させ、単球8におけるレドックス恒常性を破壊する。シュウ酸塩が豊富な食事の摂取は、腎尿細管損傷を引き起こし、腎臓結石形成に対して保護されている尿中高分子の産生および機能を変える可能性のある結晶尿素を引き起こす可能性がある15,16。いくつかの研究は尿の結晶が尿のpHおよび温度に応じて形および大きさを変えることができることを実証した17,18,19.また、尿タンパク質は結晶挙動20を調節することが示されている。Daudon et al.19は、結晶管内分析が腎臓結石疾患患者の管理および治療に対する応答の評価に役立つ可能性があることを提案した。結晶の存在を評価するために現在利用可能ないくつかの従来の方法は、偏光顕微鏡21、22、電子顕微鏡23、粒子カウンター3、尿濾過24、蒸発3、5または遠心分離21を含む。これらの研究は、結晶に関する腎臓結石分野に貴重な洞察を提供してきました。しかし、これらの方法の限界は、1μm未満の結晶のサイズを視覚化して定量できないことでした。このサイズの結晶は、ランドールのプラークに付着することにより、CaOx石の成長に影響を与える可能性があります。
ナノ結晶は、より大きな微結晶25と比較して腎細胞に広範な傷害を引き起こすことが示されている。ナノ結晶の存在は、ナノ粒子分析装置26,27を用いて尿中に報告されている。最近の研究では、蛍光標識ビスリン酸プローブ(アレンドロネート-フルオレセイン/アレンドロネート-Cy5)を用いてナノスケールフローサイトメトリー28を用いてナノ結晶を調べる。この染料の制限は、それが特異的ではなく、システインを除く石のほとんどすべてのタイプに結合することです。したがって、個人におけるナノ結晶の存在を正確に評価することは、結晶を診断したり、石のリスクを予測したりするのに有効なツールとなり得る。本研究の目的は、ナノ粒子追跡解析(NTA)を用いて、ナノ結晶を含むカルシウム(<1μmの大きさ)を検出し、定量化することであった。これを達成するために、NTA技術をカルシウム結合フルオロフォア、Fluo-4 AMと組み合わせて使用し、健康な成人の尿中のナノ結晶を含むカルシウムを検出し定量しました。
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Protocol
この研究で概説されたすべての実験は、アラバマ大学バーミンガム校(UAB)制度審査委員会によって承認されました。健康な成人(33.6±3.3歳;n=10)は、正常な血液包括代謝パネル、非タバコユーザー、非妊娠者、20〜30kg/m2のBMI、および慢性病状または急性疾患がない場合、研究に登録された。健康な参加者は、研究開始前に書面によるインフォームド・コンセント・フォームに署名しました。
1. 臨床プロトコルと尿の収集
- 参加者は、尿を採取する前に、UAB臨床・トランスレーショナルサイエンスバイオニュートリションコアが調製した低シュウ酸塩食を3日間、一晩で速く摂取してから、尿を採取します(24時間サンプル)。
- 翌日、参加者はシュウ酸塩の負荷(果物や野菜を含むスムージー、約8mMのシュウ酸塩)を消費する前に、24時間尿サンプル(シュウ酸塩前)を返してもらいます。参加者はその後、24時間尿を収集し(シュウ酸後サンプル)、翌日に尿を返します。
- 以下に示すように、すべての尿サンプルを室温(RT)で処理する前に維持し 、図1に示す。
2. 尿処理
注: 使用される材料と機器はすべて、 一覧の一覧を参照してください。
注意:臨床サンプルおよび試薬を扱っている間、常に個人的な保護具を着用してください。具体的には、手袋、顔と目の盾、呼吸保護、および防護服。
- 尿のpHと容積を測定し、記録する。50 mLの尿をラベル付きの無菌50 mL円錐管に加える前に十分に混合します。
- ベンチトップ遠心分離機を使用してRTで10分間1200 x g で遠心分離機サンプル。
注:より涼しい温度が結晶化を促進することができるので、さらなる結晶形成を防ぐためにRTでサンプルを保ちます。 - 上清を捨てて、100%エタノールの5 mLで再度ペレットを洗浄し、再懸濁します。ベンチトップ遠心分離機を使用してRTで1200 x g で10分間サンプルを遠心分離します。
- 上清を捨て、1mLの100%エタノールでペレットを再懸濁します。後で処理または後述のようにサンプルを染色するために-20°Cでサンプルを保管してください。
注: 保存されたサンプルと新しく染色されたサンプルの間にデータポイント(粒子サイズ/濃度)に大きな差はありません。
3. ナノ粒子追跡解析(NTA)
- サンプル準備
- 金ナノ粒子: 金ナノ粒子を使用して、機器の設定を最適化します。100 nmサイズの金ナノ粒子を超純水で1:1000希釈。
- ヒト尿:水中で尿サンプルを20回希釈してから、5 mM Fluo-4 AM(カルシウム蛍光色素)を暗で30分間染色します。NTA を使用してサンプルを分析します。
- 前述の29のように、カルシウムオキサレート(CaOx)結晶を調製する。水で10 mMストック溶液(水10mLで14.6mg)を50μMに希釈し、分析前に暗い状態で30分間5 mM Fluo-4 AMを使用して希釈サンプルを染色します。
- リン酸カルシウム(CaP)結晶:10mMストック溶液(水10mLで50.4mg)を水中で50μM希釈し、5 mM Fluo-4 AMを使用して希釈したサンプルを30分間暗い状態で染色してからNTA分析を行います。
- 計器のセットアップ、カメラ設定、データ収集
メモ: この方法で使用するコンピュータと計測器のセットアップは 、図 2に示されています。- コンピュータの電源を入れ、次に機器の電源を入れます。ソフトウェアを開き、カメラの電源を入れます。
- ソフトウェアウィンドウが開いたら、ウィンドウの左上隅にあるキャプチャアイコンをクリックして、キャプチャモードを開始します。カメラの初期化には数秒かかります。
- プラットフォームがきれいに見えるまで、最初に1 mLのシリンジを使用して空気をポンプで送り込み、プラットフォームを清掃します。別の1 mLシリンジを使用して装置に水を2~3回静かに加え、気泡を取り除きます。
注:プラットフォームとチューブ内の気泡を探してください。サンプルの実行前および実行中に装置全体に気泡を持たないようにすることが重要です。気泡が存在する場合は、空気と水でプラットフォームを再度清掃してください。 - プラットフォームがきれいになったら、水を加えることで、カメラを見て表面に汚染がないか確認します。次に、サンプルローディングポンプインジェクタにコントロールとして金ナノ粒子を追加し、機器をセットアップします。
- 画像が色付きピクセルを表示し始めるまで、画面上またはノブのカメラレベルをインストゥルメントの右側に調整し、カメラレベルを下げます。
- 次に、画面を調整して画像を最適化します。ビデオ画像上でマウスボタンを左クリックします。マウスの左ボタンを押したまま、画像を上下にドラッグして、ビュー全体を表示します。
注: 通常のカメラレンズとフィルターは、金ナノ粒子と染色されていないサンプルを評価するために使用されます。 - 注入速度を設定し、カメラの画面に金ナノ粒子が表示されるようにカメラをフォーカスします。初期設定の場合、金ナノ粒子が検出されるように、注入速度を高(500 μL/min)に設定します。検出後、速度を50 μL/minに下げます。
- カメラレベルを調整してパーティクルを視覚化します。染色されていないサンプルの場合は、レベル 5 で画面のゲインを調整してカメラのフォーカスを得て、カメラレベルを 8 に設定します。フォーカスが設定されたら、サンプルを記録します(つまり、1回の測定を60秒間のみ)。
注: フォーカスと連続流速は、カウント用のパーティクルの鮮明で鮮明な画像を得るために重要です。 - 最適化後、サンプルを評価する前に、再度水で洗浄してください。カメラを表示して、チューブがクリーンでパーティクルが存在しないことを確認します。
メモ:カメラでパーティクルが検出されないまで、各サンプルの間のチャンバーを洗います。 - 染色サンプルを分析するには、カメラを適切な蛍光フィルターを含むフィルター位置に調整します。希釈したサンプルをサンプルローディングポンプインジェクタにロードし、サンプルの分析のために速度を20 μL/minに下げます。
- 次に、画面のゲインとカメラレベルを調整します。染色(蛍光)サンプルの場合は、画面ゲインを5に、カメラレベルをレベル13に設定します。
注: これらのパラメータはサンプルタイプによって異なり、すべてのサンプルを最適化してフォーカスを得る必要があります。 - 標準測定を使用して、1つのキャプチャ期間が60秒間であるサンプルあたり5つのキャプチャのサンプルを測定します。
- 各測定後にデータを保存して保存します。ソフトウェアは、各測定のための画像とビデオファイルを保存します。ソフトウェアは、出力データ(例えば、結晶サイズ:10 nM - 1000 nMと濃度)をExcelとpdf形式の両方で提供します。
- 個々のサンプルの 5 つの測定値すべてについて、ナノ粒子の平均数を計算します。平均の標準偏差または標準偏差を使用してデータを分析し、ペア分析にt検定を使用します。
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Representative Results
この研究結果から、NTAはヒト尿中の尿中のナノ結晶を含むカルシウムの平均サイズと濃度を効率的に検出できることを示している。これは、フルオロフォア、フルオ4 AM、ナノ粒子追跡解析を用いて達成した。Fluo-4 AMはCaOxとCaPの両方の結晶に結合することができた。図3Aに示すように、CaOx結晶は50〜270nmの大きさであり、平均濃度は1.26 x 109粒子/mLであると判断した。CaP結晶は30〜225nmの大きさで、平均濃度は2.22 x 109粒子/mLであった(図3B)。NTAがヒト尿中のナノ結晶を評価できるかどうかを判断するために、健康な成人は、制御されたシュウ酸塩食を消費し、続いて高いシュウ酸塩負荷を摂取するよう求められた。尿中ナノクリスタルの大きさと濃度を評価するために、負荷の前後に24時間の尿サンプルを採取した。プレシュウ酸尿サンプルには、110~300nmの間に尿ナノ結晶(1.65 x 108±3.29 x 107粒子/mL)が含まれていた(図4)。これに対し、シュウ酸後サンプルに存在する尿中ナノ結晶(7.05 x 10 8±1.08 x 108粒子/mL;100-320nm)に有意な増加(p<0.0001)があった(図4)。方法の再現性を確認するために、サンプルを3回測定し、技術的複製に有意な変動はなかった(図5)。
図1:ヒトの尿中ナノ結晶を単離・染色するためのプロトコル。この図の大きなバージョンを見るには、ここをクリックしてください。
図2:ナノ粒子追跡解析(NTA)の説明(A)これらの研究に用いられるコンピュータと計器のセットアップ(B)サンプルは、光学表面を充填する前に連続した速度でシリンジポンプを使用して、注入管に注入される。サンプルは対物レンズによって観察され、廃棄される出口管を通って出る前にサンプルがプラットフォームを流れるのでカメラによって捕獲される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:NTAは、Fluo-4 AM標識シュウ酸カルシウム(CaOx)およびリン酸カルシウム(CaP)結晶を検出します。 サイズ分布と濃度を示す(A)CaOxおよび(B)CaP結晶の代表的なグラフ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:NTAは、24時間用のヒト尿中ナノ結晶と標識されたFluo-4 AMを検出した。 Fluo-4 AMの代表的なグラフは、対照的なシュウ酸ダイエットで健康な成人からの24時間前シュウ酸およびポストシュウ酸塩サンプルで尿ナノ結晶を標識した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:NTAを用いた24時間尿採取におけるヒトナノ結晶の技術的複製 Fluo-4 AM AMの技術的複製は、24時間(A)の尿ナノ結晶を、シュウ酸前(B)対照シュウ酸ダイエットで健康な成人からのシュウ酸後サンプルに標識した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
NTAは、カルシウム結合プローブFluo-4 AMを用いてヒト尿中のナノ結晶を評価するために本研究で使用されている。尿中のナノ結晶を検出するための標準的な方法はありません。いくつかの研究グループは尿中のナノ結晶を検出し、サンプル27、28を定量化する能力に制限されている広範なプロトコルまたは方法の使用に依存している。この研究は、高いシュウ酸負荷を摂取することから成る食事給餌研究に参加したヒトの尿中のナノ結晶を含むカルシウムを検出するための特定の敏感な方法を示す。シュウ酸塩の消費量は、シュウ酸塩の実世界消費(例えば、1/2ほうれん草サラダ)と同等であった。
NTA は、ブラウン運動を使用して溶液30内の粒子を測定する、よく特徴付けられる高解像度ツールです。生物学的試料31、32、33の様々な生体ナノ粒子を評価するために使用されてきた。さらに、NTAは、あらゆる種類の生物学的試料中の粒子のサイズと濃度を正確に予測することができます。このメソッドは、ラベル付けは必要ありません。しかし、特定の粒子を検出するためにラベリングを使用することができます。この研究では、尿サンプル中のナノ結晶を含むカルシウムを効率的かつ特異的に検出するためにFluo-4 AMを用いた。カルシウム蛍光プローブは、最初は遊離の細胞体カルシウム34を測定するために使用された。Fluo-4は蛍光が増加する蛍光を増加させる蛍 >光35の自由カルシウム35に結合すると100倍に増加する蛍光3の類似体である。さらに、Fluo-4は、フローサイトメトリー36を用いて関節炎患者の滑液中のカルシウム粒子を評価することが示されている。そこで、これらの研究にはFluo-4 AMを用いた。
すべてのサンプルをプラットフォームに連続的に注入し、正確な検出を行った。高い流量(すなわち、50μL/min)の濃度の正確な評価、ならびに静的設定および低い流動量(すなわち20μL/min)37に比べ粒子径に影響を及ぼす可能性があるため、濃度および粒子サイズの決定は流量に依存する。従って、安定した遅い流量はサンプルに存在する粒子の数の正確な測定を提供する。パーティクルの数とサイズに影響を与える可能性のあるその他の重要なパラメータには、カメラ レベル、検出しきい値、フォーカス38、39、40などがあります。サンプルでの一貫した粒子測定(CV約20%)現在の研究で観察されたが、これは別の研究39からの知見と一致していた。最後に、ヒト尿中のナノ結晶の存在が電子顕微鏡29を用いて確認された。この研究は、NTAがヒトからの尿ナノ結晶を正常に測定できることを実証している。
このプロトコルの利点の1つは、Fluo-4 AMを使用して溶液中のカルシウム含有粒子を評価することです。もう1つの利点は、試料内のナノ結晶の検出において観察される最小限の変動性である。この設定におけるNTAの1つの制限は、ナノ結晶の形態を区別できないことである。しかし、この方法は、腎臓結石を含むカルシウムの歴史を持つ個人の石のリスクを予測するための結晶を検出するのに有益であり得る。このプロトコルは、現在の方法論を置き換えることはできませんが、尿ナノ結晶に関する新しい洞察を提供する可能性があります。尿中カルシウム含有結晶を評価するNTAの使用は、上記の標準的な顕微鏡および方法を超えたナノ結晶の重要性を強調すべき新しいアプローチである。腎臓結石集団におけるこの方法の信頼性を探るために、追加の調査が保証されている。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
著者らは、すべての研究参加者とUAB CCTSバイオニュートリションコアとUAB高解像度イメージングサービスセンターの貢献に感謝しています。この研究は、NIH助成金DK106284とDK123542(TM)、UL1TR003096(国立トランスレーショナルサイエンス推進センター)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |
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