Hensikten med denne studien var å avgjøre om nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) kunne oppdage og kvantifisere kalsium i urin som inneholder nanokrystaller fra friske voksne. Funnene fra den nåværende studien tyder på at NTA kan være et potensielt verktøy for å estimere urin nanokrystaller under nyresteinssykdom.
Nyrestein blir mer utbredt over hele verden hos voksne og barn. Den vanligste typen nyrestein består av kalsiumoksalat (CaOx) krystaller. Crystalluria oppstår når urin blir overmettet med mineraler (f.eks. kalsium, oksalat, fosfat) og går foran nyresteindannelse. Standardmetoder for å vurdere crystalluria i steinforseninger inkluderer mikroskopi, filtrering og sentrifugering. Imidlertid oppdager disse metodene primært mikrokrystaller og ikke nanokrystaller. Nanokrystaller har blitt foreslått å være mer skadelige for nyre epitelceller enn mikrokrystaller in vitro. Her beskriver vi Nanopartikkelsporingsanalysens evne (NTA) til å oppdage humane urin nanokrystaller. Friske voksne ble matet et kontrollert oksalatdiett før de drakk en oksalatbelastning for å stimulere urin nanokrystaller. Urin ble samlet inn i 24 timer før og etter oksalatbelastningen. Prøver ble behandlet og vasket med etanol for å rense prøver. Urin nanokrystaller ble farget med kalsiumbindende fluorofor, Fluo-4 AM. Etter farging ble størrelsen og tellingen av nanokrystaller bestemt ved hjelp av NTA. Funnene fra denne studien viser at NTA effektivt kan oppdage nanokrystalluri hos friske voksne. Disse funnene tyder på at NTA kan være en verdifull tidlig deteksjonsmetode for nanokrystalluri hos pasienter med nyresteinssykdom.
Urinkrystaller dannes når urinen blir overmettet med mineraler. Dette kan forekomme hos friske individer, men er mer vanlig hos personer med nyrestein1. Tilstedeværelsen og akkumuleringen av urinkrystaller kan øke risikoen for å utvikle en nyrestein. Spesielt skjer dette når krystaller binder seg til Randalls plakk, kjernelegemer, akkumulerer og vokser over tid2,3,4. Crystalluria går foran nyresteindannelse og vurdering av crystalluria kan ha prediktiv verdi i nyrestein tidligere3,5. Spesielt har crystalluria blitt foreslått å være nyttig for å forutsi risikoen for tilbakefall av stein hos pasienter med en historie med kalsiumoksalat som inneholder stein6,7.
Krystaller har blitt rapportert å negativt påvirke nyre epitelial og sirkulerende immuncellefunksjon8,9,10,11,12,13. Det har tidligere blitt rapportert at sirkulerende monocytter fra kalsiumoksalat (CaOx) nyrestein tidligere har undertrykt cellulær bioenergi sammenlignet med friske individer14. I tillegg reduserer CaOx-krystaller cellulær bioenergi og forstyrrer redoks homeostase i monocytter8. Forbruk av måltider rik på oksalat kan forårsake krystalliuri som kan føre til nyre tubule skade og endre produksjon og funksjon av urin makromolekyler som er beskyttende mot nyrestein formasjon15,16. Flere studier har vist at urinkrystaller kan variere i form og størrelse avhengig av pH og temperaturen på urinen17,18,19. Videre har urinproteiner vist seg å modulere krystalladferd20. Daudon et al.19, foreslo at crystalluria analyse kunne være nyttig i håndteringen av pasienter med nyrestein sykdom og i vurderingen av deres respons på terapier. Noen konvensjonelle metoder som for tiden er tilgjengelige for å evaluere tilstedeværelsen av krystaller inkluderer polarisert mikroskopi21,22, elektronmikroskopi23, partikkeltellere3, urinfiltrering24, fordampning3,5 eller sentrifugering21. Disse studiene har gitt verdifull innsikt i nyresteinfeltet angående krystalliuri. En begrensning av disse metodene har imidlertid vært manglende evne til å visualisere og kvantifisere krystaller som er mindre enn 1 μm i størrelse. Krystaller av denne størrelsen kan påvirke veksten av CaOx-steiner ved å feste seg til Randalls plakett.
Nanokrystaller har vist seg å forårsake omfattende skade på nyreceller sammenlignet med større mikrokrystaller25. Tilstedeværelsen av nanokrystaller er rapportert i urin ved hjelp av en nanopartikkelanalysator26,27. Nyere studier har brukt fluorescerende merket bisfosfat sonder (alendronat-fluorescein / alendronat-Cy5) for å undersøke nanokrystaller ved hjelp av nanoskala strømning cytometri28. Begrensningen av dette fargestoffet er at det ikke er spesifikt og vil binde seg til nesten alle typer steiner unntatt cystein. Dermed kan nøyaktig vurdering av tilstedeværelsen av nanokrystaller hos individer være et effektivt verktøy for å diagnostisere krystalliuri og / eller forutsi steinrisiko. Hensikten med denne studien var å oppdage og kvantifisere kalsiumholdige nanokrystaller (<1 μm i størrelse) ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). For å oppnå dette ble NTA-teknologi brukt i kombinasjon med en kalsiumbindende fluorofor, Fluo-4 AM for å oppdage og kvantifisere kalsiumholdige nanokrystaller i urinen til friske voksne.
NTA har blitt brukt i den nåværende studien for å vurdere nanokrystaller i human urin ved hjelp av en kalsiumbindende sonde, Fluo-4 AM. Det er ingen standardmetode tilgjengelig for å oppdage nanokrystaller i urinen. Noen forskningsgrupper har oppdaget nanokrystaller i urinen og stolt på bruk av omfattende protokoller eller metoder som er begrenset i deres evne til å kvantifisere prøvene27,28. Denne studien viser en spesifikk og sensitiv metode for å oppda…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker alle studiedeltakere og UAB CCTS Bionutrition Core og UAB High Resolution Imaging Service Center for deres bidrag. Dette arbeidet ble støttet av NIH grants DK106284 og DK123542 (TM) og UL1TR003096 (National Center for Advancing Translational Sciences).
Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |