Estimering av urin nanokrystaller hos mennesker ved bruk av kalsiumfluoformerking og nanopartikkelsporingsanalyse

Summary

Hensikten med denne studien var å avgjøre om nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) kunne oppdage og kvantifisere kalsium i urin som inneholder nanokrystaller fra friske voksne. Funnene fra den nåværende studien tyder på at NTA kan være et potensielt verktøy for å estimere urin nanokrystaller under nyresteinssykdom.

Abstract

Nyrestein blir mer utbredt over hele verden hos voksne og barn. Den vanligste typen nyrestein består av kalsiumoksalat (CaOx) krystaller. Crystalluria oppstår når urin blir overmettet med mineraler (f.eks. kalsium, oksalat, fosfat) og går foran nyresteindannelse. Standardmetoder for å vurdere crystalluria i steinforseninger inkluderer mikroskopi, filtrering og sentrifugering. Imidlertid oppdager disse metodene primært mikrokrystaller og ikke nanokrystaller. Nanokrystaller har blitt foreslått å være mer skadelige for nyre epitelceller enn mikrokrystaller in vitro. Her beskriver vi Nanopartikkelsporingsanalysens evne (NTA) til å oppdage humane urin nanokrystaller. Friske voksne ble matet et kontrollert oksalatdiett før de drakk en oksalatbelastning for å stimulere urin nanokrystaller. Urin ble samlet inn i 24 timer før og etter oksalatbelastningen. Prøver ble behandlet og vasket med etanol for å rense prøver. Urin nanokrystaller ble farget med kalsiumbindende fluorofor, Fluo-4 AM. Etter farging ble størrelsen og tellingen av nanokrystaller bestemt ved hjelp av NTA. Funnene fra denne studien viser at NTA effektivt kan oppdage nanokrystalluri hos friske voksne. Disse funnene tyder på at NTA kan være en verdifull tidlig deteksjonsmetode for nanokrystalluri hos pasienter med nyresteinssykdom.

Introduction

Urinkrystaller dannes når urinen blir overmettet med mineraler. Dette kan forekomme hos friske individer, men er mer vanlig hos personer med nyrestein¹. Tilstedeværelsen og akkumuleringen av urinkrystaller kan øke risikoen for å utvikle en nyrestein. Spesielt skjer dette når krystaller binder seg til Randalls plakk, kjernelegemer, akkumulerer og vokser over tid^2,3,4. Crystalluria går foran nyresteindannelse og vurdering av crystalluria kan ha prediktiv verdi i nyrestein tidligere^3,5. Spesielt har crystalluria blitt foreslått å være nyttig for å forutsi risikoen for tilbakefall av stein hos pasienter med en historie med kalsiumoksalat som inneholder stein^6,7.

Krystaller har blitt rapportert å negativt påvirke nyre epitelial og sirkulerende immuncellefunksjon^{8,9,10,11,12,13}. Det har tidligere blitt rapportert at sirkulerende monocytter fra kalsiumoksalat (CaOx) nyrestein tidligere har undertrykt cellulær bioenergi sammenlignet med friske individer¹⁴. I tillegg reduserer CaOx-krystaller cellulær bioenergi og forstyrrer redoks homeostase i monocytter⁸. Forbruk av måltider rik på oksalat kan forårsake krystalliuri som kan føre til nyre tubule skade og endre produksjon og funksjon av urin makromolekyler som er beskyttende mot nyrestein formasjon^15,16. Flere studier har vist at urinkrystaller kan variere i form og størrelse avhengig av pH og temperaturen på urinen^17,18,19. Videre har urinproteiner vist seg å modulere krystalladferd²⁰. Daudon et al.¹⁹, foreslo at crystalluria analyse kunne være nyttig i håndteringen av pasienter med nyrestein sykdom og i vurderingen av deres respons på terapier. Noen konvensjonelle metoder som for tiden er tilgjengelige for å evaluere tilstedeværelsen av krystaller inkluderer polarisert mikroskopi^21,22, elektronmikroskopi²³, partikkeltellere³, urinfiltrering²⁴, fordampning^3,5 eller sentrifugering²¹. Disse studiene har gitt verdifull innsikt i nyresteinfeltet angående krystalliuri. En begrensning av disse metodene har imidlertid vært manglende evne til å visualisere og kvantifisere krystaller som er mindre enn 1 μm i størrelse. Krystaller av denne størrelsen kan påvirke veksten av CaOx-steiner ved å feste seg til Randalls plakett.

Nanokrystaller har vist seg å forårsake omfattende skade på nyreceller sammenlignet med større mikrokrystaller²⁵. Tilstedeværelsen av nanokrystaller er rapportert i urin ved hjelp av en nanopartikkelanalysator^26,27. Nyere studier har brukt fluorescerende merket bisfosfat sonder (alendronat-fluorescein / alendronat-Cy5) for å undersøke nanokrystaller ved hjelp av nanoskala strømning cytometri²⁸. Begrensningen av dette fargestoffet er at det ikke er spesifikt og vil binde seg til nesten alle typer steiner unntatt cystein. Dermed kan nøyaktig vurdering av tilstedeværelsen av nanokrystaller hos individer være et effektivt verktøy for å diagnostisere krystalliuri og / eller forutsi steinrisiko. Hensikten med denne studien var å oppdage og kvantifisere kalsiumholdige nanokrystaller (<1 μm i størrelse) ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). For å oppnå dette ble NTA-teknologi brukt i kombinasjon med en kalsiumbindende fluorofor, Fluo-4 AM for å oppdage og kvantifisere kalsiumholdige nanokrystaller i urinen til friske voksne.

Protocol

Alle eksperimenter skissert i dette arbeidet ble godkjent av University of Alabama ved Birmingham (UAB) Institutional Review Board. Friske voksne (33,6 ± 3,3 år; n =10) ble inkludert i studien hvis de hadde et normalt blod omfattende metabolsk panel, ikke-tobakksbrukere, ikke-gravide, en BMI mellom 20-30 kg / m2, og fri for kroniske medisinske tilstander eller akutte sykdommer. Friske deltakere signerte et skriftlig informert samtykkeskjema før studiestart. 1. Klinisk protokoll og …

Representative Results

Funnene fra denne studien viser at NTA effektivt kan oppdage gjennomsnittsstørrelsen og konsentrasjonen av kalsium som inneholder urin nanokrystaller i human urin. Dette ble oppnådd ved hjelp av fluorofor, Fluo-4 AM og nanopartikkelsporingsanalyse. Fluo-4 AM var i stand til å binde seg til både CaOx og CaP krystaller. Som vist i figur 3Able CaOx-krystaller fastslått å være mellom 50-270 nm i størrelse og har en gjennomsnittlig konsentrasjon på 1,26 x 109 partikler / ml. C…

Discussion

NTA har blitt brukt i den nåværende studien for å vurdere nanokrystaller i human urin ved hjelp av en kalsiumbindende sonde, Fluo-4 AM. Det er ingen standardmetode tilgjengelig for å oppdage nanokrystaller i urinen. Noen forskningsgrupper har oppdaget nanokrystaller i urinen og stolt på bruk av omfattende protokoller eller metoder som er begrenset i deres evne til å kvantifisere prøvene^27,28. Denne studien viser en spesifikk og sensitiv metode for å oppda…

Materials

Benchtop Centrifuge	Jouan Centrifuge	CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate	Synthesized in the lab as previously described29.		Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder)	Sigma	677418	Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol	Fischer Scientific	AC615095000	Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM*	AAT Bioquest, Inc.	20550	Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles	Sigma	742031	Store at 2-8°C
NanoSight Instrument	Malvern Instruments, UK	NS300
Syringe pump	Harvard Apparatus	98-4730
Virkon Disinfectant	LanXESS Energizing Company, Germany	LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.