Uppskattning av urinnanokristaler hos människor med kalciumfluoroformärkning och nanopartikelspårningsanalys

Summary

Syftet med denna studie var att avgöra om nanopartikelspårningsanalys (NTA) kunde upptäcka och kvantifiera urinkalcium som innehåller nanokristaler från friska vuxna. Resultaten från den aktuella studien tyder på nta kan vara ett potentiellt verktyg för att uppskatta urinarie nanokristaler under njursten sjukdom.

Abstract

Njurstenar blir allt vanligare i hela världen hos vuxna och barn. Den vanligaste typen av njursten består av kalciumoxalatkristaller (CaOx). Crystalluria uppstår när urin blir övermättad med mineraler (t.ex. kalcium, oxalat, fosfat) och föregår njurstensbildning. Standardmetoder för att bedöma kristallluri i sten tidigare inkluderar mikroskopi, filtrering och centrifugering. Dessa metoder detekterar dock främst mikrokristaler och inte nanokristaler. Nanokristaler har föreslagits vara mer skadliga för njure epitelceller än microcrystals in vitro. Här beskriver vi nanopartikelspårningsanalysens (NTA) förmåga att upptäcka humana urinnanokristaler. Friska vuxna matades en kontrollerad oxalat diet innan du dricker en oxalat belastning för att stimulera urinvägarna nanokristaler. Urin samlades in i 24 timmar före och efter oxalatbelastningen. Prover bearbetades och tvättades med etanol för att rena prover. Urin nanokristaler var färgade med kalcium bindande fluorfor, Fluo-4 AM. Efter färgning fastställdes storleken och antalet nanokristaler med NTA. Resultaten från denna studie visar NTA kan effektivt upptäcka nanokristalluri hos friska vuxna. Dessa resultat tyder NTA kan vara en värdefull tidig upptäckt metod för nanocrystalluria hos patienter med njursten sjukdom.

Introduction

Urinkristaller bildas när urinen blir övermättad med mineraler. Detta kan förekomma hos friska individer men är vanligare hos individer med njursten¹. Närvaron och ackumuleringen av urinkristaller kan öka risken för att utveckla en njursten. Specifikt inträffar detta när kristaller binder till Randalls plack, kärna, ackumuleras och växer över^{tid 2,3,4}. Crystalluria föregår njurstensbildning och bedömning av kristallluri kan ha prediktivt värde i njursten tidigare^3,5. Specifikt har crystalluria föreslagits vara användbart för att förutsäga risken för sten återkommer hos patienter med en historia av kalciumoxalat som innehåller stenar^6,7.

Kristaller har rapporterats ha en negativ inverkan på njurepitela och cirkulerande immuncellsfunktion^{8,9,10,11,12,13}. Det har tidigare rapporterats att cirkulerande monocyter från kalciumoxalat (CaOx) njursten tidigare har undertryckt cellulära bioenergiergetika jämfört med friska individer¹⁴. Dessutom minskar CaOx kristaller cellulära bioenergetics och stör redox homeostas i monocyter⁸. Konsumtion av måltider rik på oxalat kan orsaka kristallluri som kan leda till njurmedicinska tubuleskador och ändra produktionen och funktionen hos urinerande makromolekyler som skyddar mot njurstensbildning^15,16. Flera studier har visat att urinkristaller kan variera i form och storlek beroende på pH och temperatur på^{urinen 17,18,19}. Vidare har urinproteiner visat sig modulera kristallbeteende²⁰. Daudon et al.¹⁹, föreslog att crystalluria analys kan vara till hjälp i förvaltningen av patienter med njursten sjukdom och vid bedömning av deras svar på terapier. Några konventionella metoder som för närvarande finns tillgängliga för att utvärdera förekomsten av kristaller inkluderar polariserad mikroskopi^21,22, elektronmikroskopi²³, partikelräknare³, urinfiltrering²⁴, avdunstning^3,5 eller centrifugation²¹. Dessa studier har gett värdefull inblick i njurstensfältet när det gäller kristallluri. En begränsning av dessa metoder har dock varit oförmågan att visualisera och kvantifiera kristaller som är mindre än 1 μm stora. Kristaller av denna storlek kan påverka tillväxten av CaOx stenar genom att fästa på Randalls plakett.

Nanokristaler har visat sig orsaka omfattande skador på njurceller jämfört med större mikrokristaler²⁵. Förekomsten av nanokristaler har rapporterats i urin med hjälp av en nanopartikelanalysator^26,27. Nyligen genomförda studier har använt fluorescerande märkta bisfosfatsonder (alendronat-fluorescein/alendronate-Cy5) för att undersöka nanokritertaler med hjälp av nanoflödescytometri²⁸. Begränsningen av detta färgämne är att det inte är specifikt och kommer att binda till nästan alla typer av stenar utom cystein. Således, noggrant bedöma förekomsten av nanokristaller hos individer kan vara ett effektivt verktyg för att diagnostisera crystalluria och/eller förutsäga stenrisk. Syftet med denna studie var att upptäcka och kvantifiera kalcium som innehåller nanokristaler (<1 μm i storlek) med hjälp av nanopartikelspårningsanalys (NTA). För att uppnå detta användes NTA-tekniken i kombination med en kalciumbindande fluorfor, Fluo-4 AM för att upptäcka och kvantifiera kalcium som innehåller nanokristaler i urinen hos friska vuxna.

Protocol

Alla experiment som beskrivs i detta arbete godkändes av University of Alabama at Birmingham (UAB) Institutional Review Board. Friska vuxna (33,6 ± 3,3 år gamla; n=10) inkluderades i studien om de hade en normal blod omfattande metabolisk panel, icke-tobaksanvändare, icke-gravida, ett BMI mellan 20-30 kg/m2, och fria från kroniska medicinska tillstånd eller akuta sjukdomar. Friska deltagare undertecknade ett skriftligt informerat samtyckesformulär innan studien började. 1. Kli…

Representative Results

Resultaten från denna studie visar nta kan effektivt upptäcka den genomsnittliga storleken och koncentrationen av kalcium som innehåller urin nanokristaler i mänsklig urin. Detta uppnåddes genom att använda fluorfor, Fluo-4 AM och nanopartiklar spårning analys. Fluo-4 AM kunde binda till både CaOx och CaP kristaller. Som visas i figur 3Afastställdes CaOx-kristaller vara mellan 50-270 nm stora och ha en genomsnittlig koncentration på 1,26 x 109 partiklar/ml. CaP-kristalle…

Discussion

NTA har använts i denna studie för att bedöma nanokristaler i human urin med hjälp av en kalciumbindande sond, Fluo-4 AM. Det finns ingen standardmetod för att upptäcka nanokristaler i urinen. Vissa forskargrupper har upptäckt nanokristaler i urinen och förlitat sig på användningen av omfattande protokoll eller metoder som är begränsade i deras förmåga att kvantifiera^{proverna 27,28}. Denna studie visar en specifik och känslig metod för att upptäck…

Materials

Benchtop Centrifuge	Jouan Centrifuge	CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate	Synthesized in the lab as previously described29.		Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder)	Sigma	677418	Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol	Fischer Scientific	AC615095000	Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM*	AAT Bioquest, Inc.	20550	Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles	Sigma	742031	Store at 2-8°C
NanoSight Instrument	Malvern Instruments, UK	NS300
Syringe pump	Harvard Apparatus	98-4730
Virkon Disinfectant	LanXESS Energizing Company, Germany	LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.