Syftet med denna studie var att avgöra om nanopartikelspårningsanalys (NTA) kunde upptäcka och kvantifiera urinkalcium som innehåller nanokristaler från friska vuxna. Resultaten från den aktuella studien tyder på nta kan vara ett potentiellt verktyg för att uppskatta urinarie nanokristaler under njursten sjukdom.
Njurstenar blir allt vanligare i hela världen hos vuxna och barn. Den vanligaste typen av njursten består av kalciumoxalatkristaller (CaOx). Crystalluria uppstår när urin blir övermättad med mineraler (t.ex. kalcium, oxalat, fosfat) och föregår njurstensbildning. Standardmetoder för att bedöma kristallluri i sten tidigare inkluderar mikroskopi, filtrering och centrifugering. Dessa metoder detekterar dock främst mikrokristaler och inte nanokristaler. Nanokristaler har föreslagits vara mer skadliga för njure epitelceller än microcrystals in vitro. Här beskriver vi nanopartikelspårningsanalysens (NTA) förmåga att upptäcka humana urinnanokristaler. Friska vuxna matades en kontrollerad oxalat diet innan du dricker en oxalat belastning för att stimulera urinvägarna nanokristaler. Urin samlades in i 24 timmar före och efter oxalatbelastningen. Prover bearbetades och tvättades med etanol för att rena prover. Urin nanokristaler var färgade med kalcium bindande fluorfor, Fluo-4 AM. Efter färgning fastställdes storleken och antalet nanokristaler med NTA. Resultaten från denna studie visar NTA kan effektivt upptäcka nanokristalluri hos friska vuxna. Dessa resultat tyder NTA kan vara en värdefull tidig upptäckt metod för nanocrystalluria hos patienter med njursten sjukdom.
Urinkristaller bildas när urinen blir övermättad med mineraler. Detta kan förekomma hos friska individer men är vanligare hos individer med njursten1. Närvaron och ackumuleringen av urinkristaller kan öka risken för att utveckla en njursten. Specifikt inträffar detta när kristaller binder till Randalls plack, kärna, ackumuleras och växer övertid 2,3,4. Crystalluria föregår njurstensbildning och bedömning av kristallluri kan ha prediktivt värde i njursten tidigare3,5. Specifikt har crystalluria föreslagits vara användbart för att förutsäga risken för sten återkommer hos patienter med en historia av kalciumoxalat som innehåller stenar6,7.
Kristaller har rapporterats ha en negativ inverkan på njurepitela och cirkulerande immuncellsfunktion8,9,10,11,12,13. Det har tidigare rapporterats att cirkulerande monocyter från kalciumoxalat (CaOx) njursten tidigare har undertryckt cellulära bioenergiergetika jämfört med friska individer14. Dessutom minskar CaOx kristaller cellulära bioenergetics och stör redox homeostas i monocyter8. Konsumtion av måltider rik på oxalat kan orsaka kristallluri som kan leda till njurmedicinska tubuleskador och ändra produktionen och funktionen hos urinerande makromolekyler som skyddar mot njurstensbildning15,16. Flera studier har visat att urinkristaller kan variera i form och storlek beroende på pH och temperatur påurinen 17,18,19. Vidare har urinproteiner visat sig modulera kristallbeteende20. Daudon et al.19, föreslog att crystalluria analys kan vara till hjälp i förvaltningen av patienter med njursten sjukdom och vid bedömning av deras svar på terapier. Några konventionella metoder som för närvarande finns tillgängliga för att utvärdera förekomsten av kristaller inkluderar polariserad mikroskopi21,22, elektronmikroskopi23, partikelräknare3, urinfiltrering24, avdunstning3,5 eller centrifugation21. Dessa studier har gett värdefull inblick i njurstensfältet när det gäller kristallluri. En begränsning av dessa metoder har dock varit oförmågan att visualisera och kvantifiera kristaller som är mindre än 1 μm stora. Kristaller av denna storlek kan påverka tillväxten av CaOx stenar genom att fästa på Randalls plakett.
Nanokristaler har visat sig orsaka omfattande skador på njurceller jämfört med större mikrokristaler25. Förekomsten av nanokristaler har rapporterats i urin med hjälp av en nanopartikelanalysator26,27. Nyligen genomförda studier har använt fluorescerande märkta bisfosfatsonder (alendronat-fluorescein/alendronate-Cy5) för att undersöka nanokritertaler med hjälp av nanoflödescytometri28. Begränsningen av detta färgämne är att det inte är specifikt och kommer att binda till nästan alla typer av stenar utom cystein. Således, noggrant bedöma förekomsten av nanokristaller hos individer kan vara ett effektivt verktyg för att diagnostisera crystalluria och/eller förutsäga stenrisk. Syftet med denna studie var att upptäcka och kvantifiera kalcium som innehåller nanokristaler (<1 μm i storlek) med hjälp av nanopartikelspårningsanalys (NTA). För att uppnå detta användes NTA-tekniken i kombination med en kalciumbindande fluorfor, Fluo-4 AM för att upptäcka och kvantifiera kalcium som innehåller nanokristaler i urinen hos friska vuxna.
NTA har använts i denna studie för att bedöma nanokristaler i human urin med hjälp av en kalciumbindande sond, Fluo-4 AM. Det finns ingen standardmetod för att upptäcka nanokristaler i urinen. Vissa forskargrupper har upptäckt nanokristaler i urinen och förlitat sig på användningen av omfattande protokoll eller metoder som är begränsade i deras förmåga att kvantifieraproverna 27,28. Denna studie visar en specifik och känslig metod för att upptäck…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar alla studiedeltagare och UAB CCTS Bionutrition Core och UAB High Resolution Imaging Service Center för deras bidrag. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag DK106284 och DK123542 (TM) och UL1TR003096 (National Center for Advanceing Translational Sciences).
Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |