代謝標識と薄層クロマトグラフィーによる サッカロミセス・セレビシエ における中性脂質合成の解析
Summary
ここでは 、14C-酢酸を用いた酵母の代謝標識に関するプロトコルが提示され、これは中性脂質の分離のための薄層クロマトグラフィーと結合される。
Abstract
中性脂質(ヌル)は、エネルギーおよび脂質恒常性において重要な役割を果たす疎水性、無用な生体分子のクラスです。NLsはアセチルCoAからデノボを合成し、主にトリグリセリド(TG)およびステロールエステル(SE)の形で真核生物に存在する。ネルの合成を担う酵素は 、サッカロミセス・セレビシエ (酵母)からヒトまで高度に保存されており、酵母はNL代謝酵素の機能と調節を解剖するのに有用なモデル生物となっています。アセチルCoAがNL種の多様なセットに変換される方法については多くのことが知られていますが、NL代謝酵素を調節するメカニズム、および誤調節が細胞病理にどのように寄与できるかはまだ発見されています。NL種の分離と特性評価のための数多くの方法が開発され、研究の数十年にわたって使用されています。しかし、主要なNL種の包括的な特性評価のための定量的かつ単純なプロトコルは議論されていない。ここでは、酵母における主要なNL種のデノボ合成を定量化する簡便かつ適応可能な方法が提示される。薄層クロマトグラフィーと組み合わせた 14のC-酢酸代謝標識を適用して、生理学的に重要なNLの多様な範囲を分離し定量化します。
Introduction
アセチルCoAは、膜を構築し、ATPを生成し、細胞シグナル伝達を調節するための汎用性の高い生体分子通貨として機能する中性脂質(NLs)を含む多様な生体分子の基本的なビルディングブロックである1,2。これらのそれぞれの経路のいずれかにシャントされるLSの可用性は、部分的には、その貯蔵によって調節される。脂質滴(LD)は、トリグリセリド(TG)およびステロールエステル(SE)の疎水性コアからなる細胞質小器官であり、ほとんどの細胞のヌルの主な貯蔵室である。したがって、DLは、分解し、その後生化学的および代謝プロセス3、4に利用することができるDLを隔離し、調節する。NLおよびLD関連タンパク質の誤調節は、リポジストロフィーおよびメタボリックシンドローム5,6を含む病理の発症と相関することが知られている。このため、現在のLD研究は、NL合成が空間的、時間的、および多細胞生物の異なる組織にわたってどのように調節されているかに重点を置いて行われています。NLsのユビキタスな細胞の役割のために、DLの合成と調節を担当する多くの酵素は真核生物全体で保存される7.実際、一部の原核生物でさえ、DL 8にDLを保管しています。したがって、サッカロミセス・セレビシエ(出芽酵母)などの遺伝的に難解なモデル生物は、NLの合成および調節の研究に有用であった。
細胞抽出物からのNLの分離と定量は、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、超高性能液体クロマトグラフィー質量分析(UPLC-MS)9、10、11など、無数の方法で達成できます。おそらく、最も簡単な方法は、薄層クロマトグラフィー(TLC)を介して、標準曲線12、13からのその後の密度定量を可能にする。TLC は、NLs のコース粒度の分離のみを提供しますが、コストが安価で、複数のサンプルから同時に NL を迅速に分離できるため、強力な手法です。TLCを介してのNLの研究が直面している最もかなりの課題の2つは、1)NL種とその中間体の細胞豊富の広い範囲、および2)NL合成経路内の脂質中間体の親水性/疎水性の範囲である。その結果、TLCを介したNL種の定量は、典型的には最も豊富な種に限定される。しかし、14C-酢酸放射標識の導入は、NL経路内の低存在性中間体の検出を有意に高めることができる。酢酸はアセチルCoA合成酵素ACS214によってアセチルCoAに急速に変換され、これは14C-酢酸を酵母15において適切な放射性標識基質にする。さらに、疎水性のNLsとNの親水性中間体の両方の分離は、複数の溶媒システム16を使用することにより、TLCによって達成することができる。ここでは、酵母における14のC-酢酸代謝標識を用いたNLsの分離方法を提示する。パルス期間中に標識された脂質は、その後、十分に確立された全脂質単離プロトコル17によって単離され、続いてTLCによるNL種の分離が続く。標識脂質を可視化するオートラジオグラフィーと、全脂質を可視化する化学スプレーの両方によるTLCプレートの開発は、複数の定量方法を可能にする。個々の脂質バンドはまた、カミソリの刃を使用してTLCプレートから容易に抽出することができ、およびシンチレーションカウントは、バンド内の放射性標識材料の量を定量するために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、酵母におけるNL種の合成を定量的に監視する多目的な放射標識プロトコルが提示される。このプロトコルは非常にモジュラーで、3-6日以内に手続きを終わらせることができます。さらに、脂質種と代謝産物を分離するためのTLCの使用に関する豊富な文献が存在し、これはユーザーがTLC溶媒系16,19の単純な変化で関心のあるいくつかの脂質?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この研究の完了に関するヘルプと概念的なアドバイスをヘンネ研究所のメンバーに感謝したいと考えています。W.M.H.は、ウェルチ財団(I-1873)、NIH NIGMS(GM119768)、アラパレスギアン医学研究基金、UT南西部寄付奨学生プログラムからの資金によって支えられています。S.R は T32 プログラム交付 (5T32GM008297) によってサポートされています。
Materials
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. “Bligh and Dyer” and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
