用于体外和体内研究的小鼠不变的自然杀伤T细胞的纯化与扩增

摘要

我们描述了一种快速且稳健的方案，用于从小鼠脾脏中富集不变的自然杀伤T（iNKT）细胞，并在体外扩增至适合体外和体内研究的细胞数量。

摘要

不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）是一类具有固有免疫特性的T淋巴细胞，表达一种保守的半不变T细胞受体（TCR），该受体特异性识别由非多态性MHC I类相关分子CD1d呈递的自身或微生物脂类抗原。临床前和临床研究均支持iNKT细胞在癌症、自身免疫病和感染性疾病中的重要作用。iNKT细胞在不同物种间高度保守，其研究得益于多种小鼠模型，包括CD1d缺陷型或iNKT细胞缺陷型小鼠，以及利用CD1d四聚体或针对半不变TCR的单克隆抗体在小鼠和人类中明确检测iNKT细胞的技术手段。然而，iNKT细胞数量稀少，需扩增至足够数量方可开展研究。由于体外建立原代小鼠iNKT细胞系存在困难，我们建立了一种稳定可靠的方案，用于从iVα14-Jα18转基因小鼠（iVα14Tg）脾脏中分离和扩增iNKT细胞，这类小鼠中iNKT细胞的频率高出约30倍。本文表明，可通过免疫磁珠分选方法富集原代脾脏iVα14Tg iNKT细胞，获得纯度约为95–98%的细胞群体。纯化的iNKT细胞通过抗CD3/CD28磁珠联合IL-2和IL-7刺激，在培养第14天时可实现约30倍的扩增，细胞纯度达85–99%。扩增后的iNKT细胞易于进行遗传操作，为体外研究其活化与功能机制提供了极为宝贵的工具，更重要的是，也可用于体内过继转移实验。

引言

不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）是一类具有固有免疫特性的T淋巴细胞，表达一种半不变的αβ T细胞受体（TCR）。在小鼠中，该受体由不变的Vα14-Jα18链与一组有限的多样化Vβ链配对形成¹，可特异性识别由MHC I类相关分子CD1d呈递的脂类抗原²。iNKT细胞经历一种激动性选择程序，使其在胸腺内即获得活化/固有效应表型，该过程经历多个成熟阶段^3,4，并产生CD4⁺和CD4^-两个亚群。通过该程序，iNKT细胞获得不同的辅助性T细胞（T_H）效应表型，即T_H1（iNKT1）、T_H2（iNKT2）和T_H17（iNKT17），分别可通过转录因子T-bet、GATA3、PLZF和RORγt的表达加以识别⁵。iNKT细胞可识别多种微生物脂类，同时也对内源性脂类具有自身反应性，这些内源性脂类在细胞应激和组织损伤等病理情况下（如癌症和自身免疫疾病）表达上调²。激活后，iNKT细胞通过直接接触和细胞因子分泌来调节其他固有免疫和适应性免疫效应细胞的功能²。

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方案

本研究所述操作程序已通过圣拉斐尔科学研究所机构动物护理和使用委员会（IACUC）（编号1048）的审查和批准。

注意：所有操作均须在无菌条件下进行。所用试剂均列于材料表中。

1. 脾脏处理

1. 通过吸入 CO 对 iVα14-Jα18 小鼠实施安乐死₂ 根据机构政策。
   注意：iVα14-Jα18 小鼠必须为 8 周龄或以上。为避免体内细胞移植时发生排斥反应，需注意：来自雌性小鼠的细胞可移植至雄性和雌性受体，而来自雄性小鼠的细胞仅可移植至雄性受体。对于体外实验，则无需考虑性别差异。可合并更多小鼠以获得更大量的细胞。
2. 解剖小鼠脾脏，通过70 nm细胞筛过滤，加入10 mL含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS），制备单细胞悬液。
3. 300 × g 离心 5 分钟。
4. 倒置去除上清液，加入红细胞裂解缓冲液进行处理。用1 mL无菌ACK（氯化铵-氯化钾）裂解缓冲液重悬细胞沉淀，在室温下孵育3分钟，然后加入5 mL含2% FBS的PBS进行封闭。以300 × g离心5分钟。
   注意：ACK 可商业获得；其成分为含有 0.15 M NH₄Cl、0.01 M KHCO₃ 和 0.1 mM EDTA 的溶液，用于裂解红细胞。₄Cl, 10 mM KHC....

结果

本论文所述方案可通过免疫磁珠分离法从小鼠脾脏中富集iNKT细胞，该过程如图1A所示。首先通过去除B细胞和单核细胞对脾脏总T细胞进行阴性筛选，随后使用负载PBS-57脂质抗原的CD1d四聚体对iNKT细胞进行阳性免疫磁珠分选，该四聚体可特异性地标记iNKT细胞。采用此方案可从一只iVa14-Ja18转基因小鼠的脾脏中获得约2 × 10⁶个纯度为95–98%的iNKT细胞。在阴性组分中检测不到或仅能检测到极少量iNKT细胞（图1B）。

富集后，iVa14 iNKT细胞可在抗CD3/CD28磁珠以及IL-2和IL-7存在下进行扩增（图2A），如图2B所示，在培养第+14天平均扩增约30倍。

图3A展示了iNKT细胞的.......

讨论

本文展示了一种可重复且可行的方案，用于获得数百万个可直接使用的iNKT细胞。由于这些细胞在体内数量稀少，迫切需要一种扩增方法。我们提出的方案无需特殊仪器，也无需使用大量小鼠。为减少实验所需小鼠数量，我们特意采用了iVα14-Jα18转基因小鼠。

文献中已有另一种从iVα14-Jα18转基因小鼠扩增iNKT细胞的成功方案¹⁰。该方案需要在纯化iNKT细胞前6天制备新鲜的骨髓来源树突状细胞，随后用α-半乳糖基神经酰胺（α-galactosylceramide）负载并进行照射处理，再加入IL-2和IL-7。我们认为该方案的一大优势在于减少了实验所需小鼠的数量。此外，该方案也节省时间，因为细胞培养的建立仅需一天，而非一周。当前方案可能存在的一个可重复性限制是iVα14-Jα18转基因小鼠的可获得性，尽管这些小鼠可通过商业途径获取。若缺乏此类小鼠，我们设想可使用大量野生型（WT）小鼠作为替代，但由于野生型小鼠体内iNKT细胞数量稀少，需相应优化实验方案。

在细胞培养过程中，我们通常会检测扩.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化铵-氯化钾（ACK）溶液	本实验室制备		0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
抗FITC磁珠	Miltenyi Biotec	130-048-701
抗PE磁珠	Miltenyi Biotec	130-048-801
布雷菲德菌素A	Sigma	B6542
CD19 -FITC	Biolegend	115506	克隆号 6D5
CD1d-四聚体 -PE	NIH 四聚体核心实验室		小鼠 PBS57-Cd1d-四聚体
CD4 -PeCy7	Biolegend	100528	克隆号 RM4-5
Fc阻断剂	BD Bioscience	553142
胎牛血清（FBS）	Euroclone	ECS0186L	使用前经56°C热灭活并用0.22 µm滤膜过滤
FOXP3转录因子染色缓冲液	eBioscience	00-5523-00
H2 (IAb) -FITC	Biolegend	114406	克隆号 AF6-120.1
重组人IL-2	Chiron Corp
离子霉素	Sigma	I0634
LD柱	Miltenyi Biotec	130-042-901
LS柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS缓冲液（MB）	本实验室制备		含0.5%牛血清白蛋白（BSA；Sigma-Aldrich）和2 mM EDTA
MS柱	Miltenyi Biotec	130-042-201
非必需氨基酸	Gibco	11140-035
青霉素-链霉素（Pen-Strep）	Lonza	15140-122
PermWash缓冲液	BD Bioscience	51-2091KZ
多聚甲醛（PFA）	Sigma	P6148
磷酸盐缓冲液（PBS）	EuroClone	ECB4004L
佛波酯（PMA）	Sigma	P1585
预分离滤器（30 µm）	Miltenyi Biotec	130-041-407
重组小鼠IL-7	R&D System	407-ML-025
含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基	Gibco	61870-010
丙酮酸钠	Gibco	11360-039
TCRβ -APC	Biolegend	109212	克隆号 H57-597
αCD3CD28小鼠T细胞激活Dynabeads磁珠	Gibco	11452D
β-巯基乙醇	Gibco	31350010