Purification et expansion de cellules T tueuses naturelles invariantes de souris pour des études in vitro et in vivo
Summary
Nous décrivons un protocole rapide et robuste pour enrichir les cellules T tueuses naturelles invariantes (iNKT) de la rate de souris et les étendre in vitro à des nombres appropriés pour des études in vitro et in vivo.
Abstract
Les cellules T tueuses naturelles invariantes (iNKT) sont des lymphocytes T de type inné exprimant un récepteur de lymphocytes T semi-invariants (TCR) conservé spécifique aux antigènes lipidiques auto-microbiens ou microbiens présentés par la molécule non polymorphe CD1d liée au CMH de classe I. Des études précliniques et cliniques soutiennent un rôle pour les cellules iNKT dans le cancer, l’auto-immunité et les maladies infectieuses. Les cellules iNKT sont très conservées dans toutes les espèces et leur étude a été facilitée par des modèles murins, y compris des souris déficientes en CD1d ou déficientes en iNKT, et la possibilité de les détecter sans équivoque chez les souris et les hommes atteints de tétramères CD1d ou de mAbs spécifiques du TCR semi-invariant. Cependant, les cellules iNKT sont rares et elles doivent être étendues pour atteindre des nombres gérables pour toute étude. Parce que la génération de lignée cellulaire iNKT primaire de souris in vitro s’est avérée difficile, nous avons mis en place un protocole robuste pour purifier et développer les cellules iNKT spléniques des souris transgéniques iVα14-Jα18 (iVα14Tg), dans lesquelles les cellules iNKT sont 30 fois plus fréquentes. Nous montrons ici que les cellules iNKT spléniques primaires iVα14Tg peuvent être enrichies par un processus de séparation immunomagnétique, produisant environ 95 à 98% de cellules iNKT pures. Les cellules iNKT purifiées sont stimulées par des billes anti-CD3/CD28 plus IL-2 et IL-7, ce qui entraîne une expansion de 30 fois par jour +14 de la culture avec une pureté de 85-99%. Les cellules iNKT élargies peuvent être facilement manipulées génétiquement, fournissant un outil inestimable pour disséquer les mécanismes d’activation et de fonctionnement in vitro et, plus important encore, également lors du transfert adoptif in vivo.
Introduction
Les lymphocytes T tueurs naturels invariants (cellules iNKT) sont des lymphocytes T innés qui expriment un récepteur semi-invariant des lymphocytes T αβ (TCR), formé chez la souris par une chaîne Vα14-Jα18 invariante associée à un ensemble limité de chaînes Vβ diverses1, ce qui est spécifique aux antigènes lipidiques présentés par la molécule CD1d2liée au CMH de classe I. Les cellules iNKT subissent un programme de sélection des agonistes entraînant l’acquisition d’un phénotype effecteur activé/inné déjà dans le thymus, qui se produit à travers plusieurs étapes de maturation3,4, produisant un sous-ensemble CD4+ et un CD4– . Grâce à ce programme, les cellules iNKT acquièrent des phénotypes effecteurs T auxiliaires (TH)distincts, à savoir TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) et TH17 (iNKT17), identifiables par l’expression des facteurs de transcription T-bet, GATA3, PLZF et RORγt, respectivement5. Les cellules iNKT reconnaissent une gamme de lipides microbiens mais sont également auto-réactives contre les lipides endogènes qui sont régulés à la hausse dans le contexte de situations pathologiques de stress cellulaire et de lésions tissulaires, telles que le cancer et l’auto-immunité2. Lors de l’activation, les cellules iNKT modulent les fonctions d’autres cellules effectrices immunitaires innées et adaptatives par contact direct et production de cytokines2.
Les recherches sur les cellules iNKT ont été facilitées par des modèles murins, y compris des souris déficientes en CD1d ou en Jα18, et par la production de tétramères CD1d chargés d’antigènes ainsi que par la génération d’anticorps monoclonaux (mAbs) spécifiques au TCR semi-invariant humain. Cependant, la génération de la lignée cellulaire iNKT de souris primaire s’est avérée difficile. Pour mieux caractériser les fonctions antitumorales des cellules iNKT et les utiliser pour la thérapie cellulaire adoptive, nous avons mis en place un protocole pour purifier et étendre les cellules iNKT spléniques de souris transgéniques iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, dans lequel les cellules iNKT sont 30 fois plus fréquentes que chez les souris de type sauvage.
Les cellules iNKT expansées peuvent être exploitées pour des essais in vitro et in vivo lors du transfert chez la souris. Dans ce contexte, par exemple, nous avons montré leurs puissants effets anti-tumoraux7. De plus, les cellules iNKT étendues in vitro se prêtent à une modification fonctionnelle via le transfert ou l’édition de gènes avant leur injection in vivo8,ce qui permet une analyse fonctionnelle perspicace des voies moléculaires et ouvre la voie à des thérapies cellulaires avancées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous montrons ici un protocole reproductible et réalisable pour obtenir des millions de cellules iNKT prêtes à l’emploi. En raison de la rareté de ces cellules in vivo, une méthode pour les étendre était fortement nécessaire. Le protocole que nous proposons ne nécessite ni une instrumentation particulière ni un nombre élevé de souris. Nous avons exploité des souris transgéniques iVα14-Jα18 à dessein pour réduire le nombre de souris nécessaires à la procédure.
Un autre pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Paolo Dellabona et Giulia Casorati pour leur soutien scientifique et leur lecture critique du manuscrit. Nous remercions également le NIH Tetramer Core Facility pour le tétramère CD1d de souris. L’étude a été financée par la Bourse De la Fondazione Cariplo 2018-0366 (à M.F.) et la bourse de l’Association italienne pour la recherche sur le cancer (AIRC) 2019-22604 (à G.D.).
Materials
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
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