Мы описываем быстрый и надежный протокол для обогащения инвариантных естественных Т-киллеров (iNKT) клеток из мышиной селезенки и расширения их in vitro до подходящих чисел для исследований in vitro и in vivo.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Очистка и расширение мышечных инвариантных естественных Т-киллеров для исследований in vitro и in vivo
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Инвариантные естественные Т-киллеры (iNKT) представляют собой врожденные Т-лимфоциты, экспрессирующие сохраненный полуинвариантный Т-клеточный рецептор (TCR), специфичный для собственных или микробных липидных антигенов, представленных неполиморфной молекулой CD1d, связанной с MHC класса I. Доклинические и клинические исследования подтверждают роль iNKT-клеток в раке, аутоиммунитете и инфекционных заболеваниях. Клетки iNKT очень сохранены во всех видах, и их исследование было облегчено мышиными моделями, включая мышей с дефицитом CD1d или iNKT-дефицитом, и возможностью однозначно обнаружить их у мышей и мужчин с тетрамерами CD1d или mAbs, специфичными для полуинвариантного TCR. Тем не менее, клетки iNKT редки, и их необходимо расширить, чтобы достичь управляемых чисел для любого исследования. Поскольку генерация первичной мышиной клеточной линии iNKT in vitro оказалась сложной, мы создали надежный протокол для очистки и расширения селезеночных клеток iNKT у трансгенных мышей iVα14-Jα18 (iVα14Tg), у которых клетки iNKT встречаются в 30 раз чаще. Здесь мы показываем, что первичные селезеночные iVα14Tg iNKT клетки могут быть обогащены с помощью процесса иммуномагнитного разделения, давая около 95-98% чистых клеток iNKT. Очищенные клетки iNKT стимулируются шариками против CD3/CD28 плюс IL-2 и IL-7, в результате чего к дню происходит 30-кратное расширение +14 культуры с чистотой 85-99%. Расширенными клетками iNKT можно легко генетически манипулировать, обеспечивая бесценный инструмент для препарирования механизмов активации и функционирования in vitro и, что более важно, также при приемном переносе in vivo.
Введение
Инвариантные естественные Т-клетки-киллеры (iNKT-клетки) представляют собой врожденные Т-лимфоциты, которые экспрессируют полуинвариантный рецептор αβ Т-клеток (TCR), образованный у мышей инвариантной цепью Vα14-Jα18 в паре с ограниченным набором разнообразных Vβ-цепей1,который специфичен для липидных антигенов, представленных молекулой CD1d2класса I MHC. Клетки iNKT проходят программу отбора агонистов, в результате чего уже в тимусе происходит приобретение активированного/врожденного эффекторного фенотипа, который происходит через несколько стадий созревания3,4,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Процедуры, описанные здесь, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) (No 1048) в Научном институте Сан-Раффаэле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны выполняться в стерильных условиях. Все используемые реагенты перечислены в Таблице материалов.
1. Обработка селезенки
- Усыпление мышей iVα14-Jα18 путем вдыхания CO2 в соответствии с институциональной политикой.
ПРИМЕЧАНИЕ: мыши iVα14-Jα18 должны быть старше 8 недель. Чтобы избежать отторжения клеток от переноса клеток in vivo, учтите, что клетки, выделенные у самок мы....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол, описанный в этой рукописи, позволяет обогатить клетки iNKT из селезенки трансгенных мышей iVa14-Ja18 посредством процесса иммуномагнитного разделения, обобщенного на рисунке 1А. Общие Т-клетки селезенки сначала отрицательно отбираются путем истощения В-клеток и моноцитов, за которыми следует иммуномагнитная сортировка iNKT-положительных клеток с помощью тетрамеров CD1d, нагруженных липидным антигеном PBS-57, которые позволяют специфически окрашивать только клетки iNKT. Этот протоко.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы показываем воспроизводимый и осуществимый протокол для получения миллионов готовых к использованию iNKT-клеток. Из-за нехватки этих клеток in vivo метод их расширения был крайне необходим. Протокол, который мы предлагаем, не требует ни конкретного прибора, ни большого количества мышей. Мы специально использовали трансгенных мышей iVα14-Jα18, чтобы уменьшить количество мышей, необходимых для процедуры.
Еще один успешный протокол расширения клеток iNKT от трансгенных мышей iVα14-Jα18 до.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Благодарим Паоло Делабону и Джулию Касорати за научную поддержку и критическое прочтение рукописи. Мы также благодарим NIH Tetramer Core Facility за мышиный тетрамер CD1d. Исследование финансировалось Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (для M.F.) и стипендией Итальянской ассоциации по исследованию рака (AIRC) 2019-22604 (для G.D.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Раствор хлорида аммония и калия (ACK) | в доме | 0,15М NH4Cl, 10мМ KHCO3, 0,1 мМ ЭДТА, pH 7,2-7,4 | |
| анти-FITC Микрогранулы | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| анти-PE Микрогранулы | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Брефельдин А | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | клон 6D5 |
| CD1d-тетрамер -PE | NIH ядро тетрамера | мыши PBS57-Cd1d-тетрамеры | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | клон RM4-5 |
| Fc блокатор | BD Bioscience | 553142 | |
| фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) | Euroclone | ECS0186L | термоинактивированный и отфильтрованный .22 перед использованием |
| FOXP3 Транскрипционный фактор окрашивающий буфер | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | клон AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Иономицин | Sigma | i0634 | |
| LD | Колонки Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Колонки | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS буфер (MB) | в домашних условиях | 0,5% бычьей сыворотки альбумина (BSA; Sigma-Aldrich) и 2 мм ЭДТА | |
| МС колонки | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Заменимые аминокислоты | Gibco | 11140-035 | |
| Пенициллин и стрептомицин (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Фосфат буферизованный солевой раствор (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| (30 &; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Рекомбинатная мышь IL-7 | R& D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 с глутамаксом | Gibco | 61870-010 | |
| пируватом натрия | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | клоном H57-597 |
| α CD3CD28 мышиный активатор T Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-меркаптоэтанол | Gibco | 31350010 |
Ссылки
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
