تضخم الهواء من الرئتين مورين مع الأوعية الدموية تثبيت التخبط
Summary
يقدم هو وسيلة لتضخم الهواء مع الأوعية الدموية تثبيت الرئتين التي تحافظ على موقع الخلايا داخل الشعب الهوائية، الحويصلات الهوائية وبينستيتيوم لتحليل هيكل وظيفة. يتم الحفاظ على ضغط مجرى الهواء المستمر مع غرفة تضخم الهواء في حين يتم تثبيت perfused عبر البطين الأيمن. تتم معالجة الرئتين للدراسات النسيجية.
Abstract
غالبا ما يستخدم علم الأنسجة الرئوية للتحقيق في المساهمات التي تقدمها خلايا المجال الجوي أثناء التوازن الرئوي ومسببات الأمراض. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي طرق التثبيت الشائعة الاستخدام القائمة على الغرس إلى إزاحة خلايا المجال الجوي والمخاط إلى الشعب الهوائية الطرفية ويمكن أن تغير مورفولوجيا الأنسجة. وبالمقارنة، فإن تقنيات تثبيت التخثر الوعائي متفوقة في الحفاظ على موقع الخلايا ومورفولوجيا داخل المجال الجوي وبطانة المخاطية. ومع ذلك ، إذا لم يتم تطبيق ضغط مجرى الهواء الإيجابي في وقت واحد ، فقد تنهار مناطق الرئتين وقد تنتفخ الشعيرات الدموية في مساحات الحويصلات الهوائية ، مما يؤدي إلى تشويه تشريح الرئة. هنا، ونحن نصف طريقة رخيصة لتضخم الهواء أثناء تثبيت التشوش الأوعية الدموية للحفاظ على مورفولوجيا وموقع مجرى الهواء والخلايا السنخية وبينستيتيوم في الرئتين مورين للدراسات النسيجية المصب. يتم توصيل ضغط الهواء المستمر إلى الرئتين عبر القصبة الهوائية من غرفة مغلقة مملوءة بالهواء تحافظ على الضغط عبر عمود سائل قابل للتعديل بينما يتم تثبيت المثبت من خلال البطين الأيمن.
Introduction
يمثل علم الأنسجة الرئوية المعيار الذهبي لتقييم بنية الرئة أثناء الصحة والمرض وهو واحد من الأدوات الأكثر استخداما من قبل الباحثين الرئويين1. واحدة من أهم جوانب هذه التقنية هو العزلة المناسبة والحفاظ على أنسجة الرئة ، لأن التباين في هذه الخطوة يمكن أن يؤدي إلى سوء نوعية الأنسجة والنتائج الخاطئة1،2،3. في الحيوانات الحية ، يتم تحديد حجم الرئة من خلال التوازن بين الارتداد المرن الداخلي للرئة والقوى الخارجية التي تنتقل من جدار الصدر والحجاب الحاجز عن طريق التوتر السطحي. وبناء على ذلك، عندما يتم إدخال الصدر، يتم فقدان القوى الخارجية وانهيار الرئة. أقسام النسيجية المعدة من الرئتين المنهارة لها مظهر مزدحم والحدود بين المقصورات التشريحية (أي المجال الجوي، الأوعية الدموية، وبينستيتيوم) يمكن أن يكون من الصعب التمييز. وللالتفاف على هذا التحدي، غالبا ما يضخم الباحثون الرئتين أثناء التثبيت الكيميائي بحيث يتم الحفاظ على حجم المجال الجوي والهندسة المعمارية.
يمكن نفخ الرئتين بالهواء أو السائل. يختلف الضغط اللازم لتضخيم الرئتين إلى نفس الحجم بين تضخم الهواء والسائل بسبب القوى بين الجزيئيات في واجهة الهواء السائل. مطلوب ضغط أعلى (على سبيل المثال، 25 سمH2O) أثناء تضخم الهواء من التضخم السائل (على سبيل المثال، 12 سمH2O) للتغلب على التوتر السطحي وفتح الحويصلات الهوائيةالمنهارة 4. مرة واحدة وقد جندت الحويصلات الهوائية, انخفاض الضغط يمكن أن تبقي الحويصلات الهوائية مفتوحة على نفس حجم الهضاب منحنى حجم الضغط, والضغوط تتساوى في جميع أنحاء الرئة وفقا لقانون باسكال4,5,6,7,8.
توجد طريقتان رئيسيتان لتضخم الرئة والتثبيت للحفاظ على رئتي مورين للأنسجة. الأكثر شيوعا ، يتم غرس المجال الجوي مع السائل — غالبا ما تحتوي على مثبت. والميزة الرئيسية لهذا النهج هي أنه سهل نسبيا ولا يتطلب سوى القليل من التدريب. في حين أن غرس داخل الرحم من التثبيت قد يكون المفضل في الدراسات التي تركز على الأوعية الدموية، السائل الذي يتم غرسه عبر القصبة الهوائية يميل إلى دفع خلايا مجرى الهواء القريبة والموسينات في مناطق المجال الجوي أكثر البعيدة في حين أن تضخم الهواء لا1،3،4،9،10،11. وعلاوة على ذلك، مفرزة غير مقصودة من الكريات البيض من الظهارة خلال التضخم السائل يغير مورفولوجيا بهم، مما يعطيها artifactually بسيطة، مظهرمقربة 4،10،11،12. وأخيرا ، يمكن للتضخم في الرئتين مع السائل ضغط عن غير قصد بينستيتيوم4،10،11. معا، يمكن لهذه العوامل تشويه التشريح الطبيعي والتوزيعات الخلوية داخل الرئتين المحفوظة، وبالتالي الحد من هذه التقنية.
طريقة بديلة للحفاظ على الأنسجة هو تثبيت التشوه الوعائي. في هذه الطريقة، يتم تثبيت التثبيت في الأوعية الدموية الرئوية عن طريق فينا كافا أو البطين الأيمن. تحافظ هذه الطريقة على موقع الخلايا ومورفولوجيا في تجويف المجال الجوي. ومع ذلك ، ما لم يتم تضخيم الرئتين أثناء تثبيت التشوه ، فمن المرجح أن ينهار نسيج الرئة.
التضخم الجوي مع تثبيت التشوه الوعائي يسخر نقاط القوة من كل من تقنيات التثبيت المذكورة أعلاه. هنا نحن نقدم بروتوكول لهذه التقنية. المواد والمعدات المطلوبة غير مكلفة نسبيا ويمكن الحصول عليها بسهولة وتجميعها. الإعداد المكتمل، كما هو موضح في الشكل 1A،يوفر ضغط مجرى الهواء المستمر إلى الرئتين عن طريق عمود قابل للتعديل مملوء بالسوائل بينما توفر مضخة بيرستالدية مثبتة عبر البطين الأيمن. ويمكن بعد ذلك معالجة الرئتين مع مورفولوجيا المحفوظة لمزيد من التحليلات هيكل وظيفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن استخدامها شائع، إلا أن طرق التثبيت داخل التراتشي تحل محل الكريات البيض من الشعب الهوائية ويمكن أن تغير بنية الرئة الطبيعية. طريقة تضخم الهواء مع تثبيت التشوه الوعائي التي يتم توفيرها في هذا البروتوكول يتغلب على هذه المزالق ويحافظ بشكل أكثر دقة على تشريح الرئة. مفاتيح الحصو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (NHLBI) يمنح HL140039 وHL130938. ويود المؤلفان أن يشكرا شانون هوت وجازالي ماكليندون على خبرتهما التقنية.
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S. Pressure-Volume Curves of the Respiratory System. Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. a. T., Henricks, P. a. J., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. Airway Macrophages. American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).
