אוויר-אינפלציה של ריאות מורין עם זילוף וסקולרי-קיבוע
Summary
מוצגת שיטה לאינפלציית אוויר עם זיבולון כלי דם של הריאות המשמרת את מיקום התאים בתוך דרכי הנשימה, alveoli ואינטרסטיום עבור ניתוחים פונקציה מבנה. לחץ קבוע על דרכי הנשימה נשמר עם תא אינפלציה אוויר בעוד קיבוע הוא perfused דרך החדר הימני. הריאות מעובדות למחקרים היסטולוגיים.
Abstract
היסטולוגיה ריאות משמש לעתים קרובות כדי לחקור את התרומות המסופקות על ידי תאי המרחב האווירי במהלך הומאוסטזיס ריאות ופתוגנזה המחלה. עם זאת, שיטות קיבעון מבוססות הטמעה נפוצות יכולות לעקור תאי מרחב אווירי וריר לתוך דרכי הנשימה הסופיות ויכולות לשנות את המורפולוגיה של הרקמות. לשם השוואה, טכניקות קיבוע זלוף כלי דם עדיפים על שימור המיקום והמורפולוגיה של תאים במרחב האווירי ובבטנה הרירית. עם זאת, אם לחץ חיובי על דרכי הנשימה אינו מיושם בו זמנית, אזורים של הריאות עלולים לקרוס ונימים עלולים להתבלט לתוך החללים המכתשיים, מה שמוביל לעיוות של אנטומיה הריאות. להלן, אנו מתארים שיטה זולה לאינפלציית אוויר במהלך זיבולון כלי דם כדי לשמר את המורפולוגיה והמיקום של תאי דרכי הנשימה והמכתש והאינטרסטיום בריאות מורין למחקרים היסטולוגיים במורד הזרם. לחץ אוויר קבוע מועבר לריאות דרך קנה הנשימה מתא אטום ומלא אוויר השומר על לחץ באמצעות עמוד נוזלי מתכוונן בעוד הקיבוטיב מחדיר דרך החדר הימני.
Introduction
היסתולוגיה של ריאות מייצגת את תקן הזהב להערכת ארכיטקטורת הריאות במהלך בריאות ומחלות והיא אחד הכלים הנפוצים ביותר על ידי חוקרי ריאות1. אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של טכניקה זו הוא בידוד ושימור נאותים של רקמת הריאה, שכן שונות בשלב זה יכולה להוביל לאיכותרקמותירודה ותוצאות שגויות 1,2,3. בבעלי חיים, נפח הריאות נקבע על ידי האיזון בין רתע אלסטי פנימי של הריאה לבין כוחות חיצוניים המועברים מקיר החזה והסרעפת על ידי מתח פני השטח. בהתאם לכך, כאשר בית החזה נכנס, כוחות חיצוניים הולכים לאיבוד והריאה מתמוטטת. לחלקים היסטולוגיים המוכנים מריאות שקרסו יש מראה צפוף וגבולות בין תאים אנטומיים (כלומר, מרחבים אוויריים, כלי דם ואינטרסטיום) יכולים להיות קשים להבחין. כדי לעקוף את האתגר הזה, החוקרים לעתים קרובות לנפח את הריאות במהלך קיבעון כימי, כך גודל המרחב האווירי ואדריכלות נשמרים.
ריאות יכולות להיות מנופחות עם אוויר או נוזל. הלחץ הדרוש כדי לנפח את הריאות לאותו נפח שונה בין אוויר לאינפלציה נזילה בשל כוחות בין-מולקולריים בממשק נוזלי האוויר. לחץ גבוה יותר (למשל, 25 ס”מ2O) נדרש במהלך אינפלציית אוויר מאשר אינפלציה נזילה (למשל, 12 ס”מ2O) כדי להתגבר על מתח פני השטח ולפתוח את alveoli שקרס4. לאחר גיוס alveoli, לחץ נמוך יותר יכול לשמור על alveoli פתוח באותו נפח כמו רמות עקומת נפח הלחץ, ולחצים להשוות בכל רחבי הריאה על פי החוק של פסקל4,5,6,7,8.
קיימות שתי שיטות עיקריות לאינפלציית ריאות וקיבעון כדי לשמר את הריאות המוריניות להיסטולוגיה. בדרך כלל, המרחבים האוויריים מוחדירים בנוזל – לעתים קרובות מכילים קיבעון. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שזה קל יחסית ודורש מעט הכשרה. בעוד הטמעה תוך-תאית של קיבעון עשויה להיות מועדפת במחקרים המתמקדים vasculature, נוזל המושרה דרך קנה הנשימה נוטה לדחוף תאים פרוקסימליים דרכי הנשימה mucins לתוך אזורים מרחב אווירי דיסטלי יותר בעוד אינפלציה אווירית לא1,3,4,9,10,11. יתר על כן, ניתוק בשוגג של לויקוציטים מן האפיתל במהלך האינפלציה הנוזלית משנה את המורפולוגיה שלהם, נותן להם מראה פשוט, מעוגל4,10,11,12. לבסוף, האינפלציה של הריאות עם נוזל יכול לדחוס בשוגג את הביניים4,10,11. יחד, גורמים אלה יכולים לעוות את האנטומיה הרגילה ואת ההתפלגות התאית בתוך הריאות המשומרות, ובכך להגביל את הטכניקה.
שיטה חלופית לשימור רקמות היא קיבוע זלוף וסקולרי. בשיטה זו, קיבוע הוא perfused לתוך vasculature ריאתי דרך הוועד הנבוב או החדר הימני. שיטה זו משמרת את המיקום והמורפולוגיה של התאים במרחב האווירי לומן. עם זאת, אלא אם כן הריאות מנופחות במהלך זילוף-קיבעון, רקמת הריאה צפויה להתמוטט.
אינפלציית אוויר עם קיבוע זלוף וסקולרי רותמת עוצמות מכל אחת מטכניקות הקיבעון הנ”ל. כאן אנו מספקים פרוטוקול לטכניקה זו. החומרים והציוד הנדרשים זולים יחסית וניתן להשיגם ולהרכיבם בקלות. ההתקנה שהושלמה, המוצגת באיור 1A, מספקת לחץ קבוע בדרכי הנשימה לריאות באמצעות עמוד מתכוונן ומלא נוזלים, בעוד משאבה פריסטלטית מספקת קיבוע דרך החדר הימני. לאחר מכן ניתן לעבד ריאות עם מורפולוגיה משומרת עבור ניתוחים של תפקוד מבנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שנעשה שימוש נפוץ, שיטות קיבעון מבוססות פנים-אופן לעקור לויקוציטים מדרכי הנשימה והוא יכול לשנות את ארכיטקטורת הריאות הרגילה. השיטה של אינפלציית אוויר עם זיבולון כלי דם המסופק בפרוטוקול זה מתגברת על מלכודות אלה ושומרת בצורה מדויקת יותר על אנטומיה של הריאות. המפתחות להשגת רקמות באיכו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מכון הלב, הריאות והדם הלאומי (NHLBI) מעניק HL140039 ו- HL130938. המחברים רוצים להודות שאנון הוט וג’זאלה מקלנדון על המומחיות הטכנית שלהם.
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S. Pressure-Volume Curves of the Respiratory System. Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. a. T., Henricks, P. a. J., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. Airway Macrophages. American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).
