Luft-Aufblasen der murinen Lunge mit vaskulärer Perfusionsfixierung
Summary
Vorgestellt wird eine Methode zur Luftinflation mit vaskulärer Perfusionsfixierung der Lunge, die die Position von Zellen in Atemwegen, Alveolen und Interstitium für Struktur-Funktions-Analysen bewahrt. Der konstante Atemwegsdruck wird mit einer Luftfüllkammer aufrechterhalten, während das Fixiermittel über den rechten Ventrikel perfundiert wird. Lungen werden für histologische Studien verarbeitet.
Abstract
Die Lungenhistologie wird häufig verwendet, um die Beiträge von Luftraumzellen während der Lungenöostase und krankheitspathogenese zu untersuchen. Häufig verwendete Instillations-basierte Fixierungsmethoden können jedoch Luftraumzellen und Schleim in die terminalen Atemwege verdrängen und die Gewebemorphologie verändern. Im Vergleich dazu sind vaskuläre Perfusionsfixierungstechniken überlegen, um die Position und Morphologie von Zellen innerhalb der Lufträume und der Schleimhaut zu erhalten. Wenn jedoch nicht gleichzeitig ein positiver Atemwegsdruck ausgeübt wird, können Regionen der Lunge kollabieren und Kapillaren können sich in die Alveolarräume wölben, was zu einer Verzerrung der Lungenanatomie führt. Hierin beschreiben wir eine kostengünstige Methode zum Aufblasen der Luft während der vaskulären Perfusionsfixierung, um die Morphologie und Lage von Atemwegs- und Alveolarzellen und Interstitium in murinen Lungen für nachgeschaltete histologische Studien zu erhalten. Konstanter Luftdruck wird über die Luftröhre aus einer versiegelten, luftgefüllten Kammer, die den Druck über eine einstellbare Flüssigkeitssäule aufrechterhält, an die Lunge abgegeben, während das Fixiermittel durch den rechten Ventrikel durchblutet wird.
Introduction
Die Lungenhistologie stellt den Goldstandard für die Beurteilung der Lungenarchitektur während gesundheitlich und krank dar und ist eines der am häufigsten verwendeten Werkzeuge von Lungenforschern1. Einer der kritischsten Aspekte dieser Technik ist die richtige Isolierung und Erhaltung von Lungengewebe, da variabilität in diesem Schritt zu schlechter Gewebequalität und fehlerhaften Ergebnissen führen kann1,2,3. Bei lebenden Tieren wird das Lungenvolumen durch das Gleichgewicht zwischen dem nach innen elastischen Rückstoß der Lunge und den nach außen übertragenen Kräften bestimmt, die von der Brustwand und dem Zwerchfell durch Oberflächenspannung übertragen werden. Dementsprechend gehen beim Eintritt in den Thorax äußere Kräfte verloren und die Lunge kollabiert. Histologische Abschnitte, die aus kollabierten Lungen hergestellt werden, haben ein überfülltes Aussehen und Grenzen zwischen anatomischen Kompartimenten (dh Lufträumen, Gefäßen und Interstitium) können schwer zu unterscheiden sein. Um diese Herausforderung zu umgehen, blasen Forscher die Lunge während der chemischen Fixierung oft auf, so dass die Größe und Architektur des Luftraums erhalten bleibt.
Lungen können mit Luft oder Flüssigkeit aufgeblasen werden. Der Druck, der notwendig ist, um die Lunge auf das gleiche Volumen aufzublasen, unterscheidet sich zwischen Luft- und Flüssigkeitsaufblasen aufgrund von intermolekularen Kräften an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Beim Luftaufblasen ist ein höherer Druck (z. B.25cmH 2 O) erforderlich als beim Flüssigkeitsaufblasen (z. B. 12 cmH2O), um die Oberflächenspannung zu überwinden und die kollabierten Alveolen zu öffnen4. Sobald die Alveolen rekrutiert wurden, kann ein niedrigerer Druck die Alveolen auf das gleiche Volumen wie die Druck-Volumen-Kurve Plateaus offen halten, und die Drücke gleichen sich in der gesamten Lunge nach Pascals Gesetz4,5,6,7,8aus.
Es gibt zwei Hauptmethoden der Lungeninflation und -fixierung, um die mausige Lunge für die Histologie zu erhalten. Am häufigsten werden die Lufträume mit Flüssigkeit eingeträufert – oft mit einem Fixiermittel. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, dass er relativ einfach ist und wenig Training erfordert. Während die intratracheale Instillation von Fixativmitteln in Studien, die sich auf das Gefäßsystem konzentrieren, bevorzugt werden kann, neigt Flüssigkeit, die über die Luftröhre eingeträufelt wird, dazu, proximale Atemwegszellen und Mucine in distalere Luftraumregionen zudrücken,während die Luftinflation nicht1,3,4,9,10,11. Darüber hinaus verändert die versehentliche Ablösung von Leukozyten vom Epithel während des flüssigen Aufblasens ihre Morphologie und verleiht ihnen künstlich ein einfaches, abgerundetes Aussehen4,10,11,12. Schließlich kann das Aufblasen der Lunge mit Flüssigkeit unbeabsichtigt das Interstitiumkomprimieren 4,10,11. Zusammen können diese Faktoren die normale Anatomie und die Zellulären Verteilungen innerhalb der konservierten Lunge verzerren und so die Technik einschränken.
Eine alternative Methode der Gewebeerhaltung ist die vaskuläre Perfusionsfixierung. Bei dieser Methode wird das Fixiermittel über die Hohlvene oder den rechten Ventrikel in das Lungengefäß perfundiert. Diese Methode bewahrt die Position und Morphologie von Zellen im Luftraumlumen. Wenn die Lunge jedoch während der Perfusionsfixierung nicht aufgeblasen wird, wird das Lungengewebe wahrscheinlich kollabieren.
Luftblasen mit vaskulärer Perfusionsfixierung nutzen die Stärken aus jeder der oben genannten Fixierungstechniken. Hierin stellen wir ein Protokoll für diese Technik zur Verfügung. Die benötigten Materialien und Geräte sind relativ kostengünstig und können leicht beschafft und montiert werden. Der fertige Aufbau, der in Abbildung 1Adargestellt ist, sorgt über eine einstellbare, flüssigkeitsgefüllte Säule für einen konstanten Atemwegsdruck in der Lunge, während eine Peristaltikpumpe das Fixiermittel über den rechten Ventrikel liefert. Lungen mit erhaltener Morphologie können dann für Struktur-Funktions-Analysen weiterverarbeitet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl häufig verwendet, verdrängen intratracheale Fixierungsmethoden Leukozyten aus den Atemwegen und können die normale Lungenarchitektur verändern. Die in diesem Protokoll vorgesehene Methode der Luftinflation mit vaskulärer Perfusionsfixierung überwindet diese Fallstricke und bewahrt die Lungenanatomie genauer. Zu den Schlüsseln zur Gewinnung von hochwertigem Gewebe aus der vaskulären Perfusionsfixierungsmethode gehören die sorgfältige Überwachung des Luftfülldrucks, die Vermeidung von Luftlecks und die S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) mit den Zuschüssen HL140039 und HL130938 finanziert. Die Autoren danken Shannon Hott und Jazalle McClendon für ihre technische Expertise.
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
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