Luftinflasjon av murin lunger med vaskulær perfusjon-fiksering
Summary
Presentert er en metode for luftinflasjon med vaskulær perfusjonsfiksering av lungene som bevarer plasseringen av celler i luftveier, alveoler og interstitium for strukturfunksjonsanalyser. Konstant luftveistrykk opprettholdes med et luftinflasjonskammer mens fixative er perfused via høyre ventrikel. Lungene behandles for histologiske studier.
Abstract
Lunge histologi brukes ofte til å undersøke bidragene fra luftromsceller under lunge homeostase og sykdomspatogenese. Imidlertid kan ofte brukte instillasjonsbaserte fikseringsmetoder fortrenge luftromsceller og slim i terminale luftveier og kan endre vevsmorfologi. Til sammenligning er vaskulære perfusjonsfikseringsteknikker overlegen til å bevare plasseringen og morfologien til celler i luftrom og slimhinnen. Men hvis positivt luftveistrykk ikke brukes samtidig, kan lungens regioner kollapse og kapillærer kan bule inn i alveolarrommene, noe som fører til forvrengning av lungeanatomien. Her beskriver vi en billig metode for luftinflasjon under vaskulær perfusjonsfiksering for å bevare morfologien og plasseringen av luftveis- og alveolarceller og interstitium i murin lunger for nedstrøms histologiske studier. Konstant lufttrykk leveres til lungene via luftrøret fra et forseglet, luftfylt kammer som opprettholder trykket via en justerbar væskekolonne mens fikseringsmiddelet perfunderes gjennom høyre ventrikel.
Introduction
Lunge histologi representerer gullstandarden for å vurdere lungearkitektur under helse og sykdom og er et av de mest brukte verktøyene av lungeforskere1. En av de mest kritiske aspektene ved denne teknikken er riktig isolasjon og bevaring av lungevev, siden variasjon i dette trinnet kan føre til dårlig vevskvalitet og feilaktige resultater1,2,3. Hos levende dyr bestemmes lungevolumet av balansen mellom indre elastisk rekyl av lungen og utover krefter overført fra brystveggen og membranen ved overflatespenning. Følgelig, når thoraxen kommer inn, går ytre krefter tapt og lungen kollapser. Histologiske seksjoner tilberedt fra kollapsede lunger har et overfylt utseende og grenser mellom anatomiske rom (dvs. luftrom, vaskulatur og interstitium) kan være vanskelig å skille mellom. For å omgå denne utfordringen blåser forskerne ofte opp lungene under kjemisk fiksering slik at luftromsstørrelsen og arkitekturen opprettholdes.
Lunger kan blåses opp med luft eller væske. Trykket som er nødvendig for å blåse lungene opp til samme volum, varierer mellom luft- og væskeinflasjon på grunn av intermolekylære krefter ved luftvæskegrensesnittet. Høyere trykk (f.eks. 25 cmH2O) kreves under luftinflasjon enn væskeinflasjon (f.eks. 12 cmH2O) for å overvinne overflatespenningen og åpne den kollapsede alveolen4. Når alveoler er rekruttert, kan et lavere trykk holde alveolene åpne til samme volum som trykkvolumkurveplatåene, og trykket utjevnes gjennom hele lungen i henhold til Pascals lov4,5,6,7,8.
To hovedmetoder for lungeinflasjon og fiksering eksisterer for å bevare murin lunger for histologi. Vanligvis er luftområdene innpodet med væske – ofte inneholder et fikseringsmiddel. Den største fordelen med denne tilnærmingen er at den er relativt enkel og krever lite trening. Mens intratrakeal instillasjon av fixative kan foretrekkes i studier som fokuserer på vaskulaturen, har væske som innpodes via luftrøret en tendens til å presse proksimale luftveisceller og muciner inn i mer distale luftromsområder mens luftinflasjonen ikke1,3,4,9,10,11. Videre endrer utilsiktet løsrivelse av leukocytter fra epitelet under flytende inflasjon deres morfologi, og gir dem et enkelt, avrundet utseende4,10,11,12. Til slutt kan inflasjonen av lungene med væske utilsiktet komprimere interstitium4,10,11. Sammen kan disse faktorene forvrenge normal anatomi og cellulære fordelinger i de bevarte lungene, og dermed begrense teknikken.
En alternativ metode for vevsbevaring er vaskulær perfusjonsfiksering. I denne metoden er fikseringsmiddel perfundert i lungevaskulaturen via vena cava eller høyre ventrikel. Denne metoden bevarer plasseringen og morfologien til celler i luftromslumen. Men med mindre lungene er oppblåst under perfusjonsfiksering, vil lungevevet sannsynligvis kollapse.
Luftinflasjon med vaskulær perfusjonsfiksering utnytter styrker fra hver av de ovennevnte fikseringsteknikkene. Her gir vi en protokoll for denne teknikken. Materialene og utstyret som kreves er relativt billige og kan enkelt oppnås og monteres. Det ferdige oppsettet, vist i figur 1A, gir konstant luftveistrykk til lungene ved hjelp av en justerbar, væskefylt kolonne mens en peristaltisk pumpe leverer fiksering via høyre ventrikel. Lunger med bevart morfologi kan deretter behandles videre for strukturfunksjonsanalyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om de ofte brukes, fortrenger intratrakealbaserte fikseringsmetoder leukocytter fra luftveiene og kan endre normal lungearkitektur. Metoden for luftinflasjon med vaskulær perfusjonsfiksering som er gitt i denne protokollen, overvinner disse fallgruvene og bevarer mer nøyaktig lungeanatomi. Nøklene til å skaffe vev av høy kvalitet fra den vaskulære perfusjonsfikseringsmetoden inkluderer nøye overvåking av luftinflasjonstrykk, unngåelse av luftlekkasjer og sikre tilstrekkelig perfusjon av fiksering i vaskulat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) tilskudd HL140039 og HL130938. Forfatterne vil takke Shannon Hott og Jazalle McClendon for deres tekniske ekspertise.
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S. Pressure-Volume Curves of the Respiratory System. Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. a. T., Henricks, P. a. J., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. Airway Macrophages. American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).
