Luftinflation av murin lungor med vaskulär perfusion-fixering
Summary
Presenteras är en metod för luft-inflation med vaskulär perfusion-fixering av lungorna som bevarar placeringen av celler i luftvägarna, alveoli och interstitium för struktur-funktion analyser. Konstant luftvägstryck upprätthålls med en luft-uppblåsningskammare medan fixering genomsyras via rätt ventrikel. Lungor bearbetas för histologic studier.
Abstract
Lung histologi används ofta för att undersöka bidrag från luftrum celler under lung homeostas och sjukdom patogenes. Vanliga instillationsbaserade fixeringsmetoder kan dock tränga undan luftrumsceller och slem till terminala luftvägar och kan förändra vävnadsmorfologin. I jämförelse är vaskulär perfusion-fixering tekniker överlägsen på att bevara platsen och morfologin av celler inom luftrum och slemhinnan foder. Men om positivt luftvägstryck inte appliceras samtidigt kan lungornas regioner kollapsa och kapillärer kan svälla in i de alveolära utrymmena, vilket leder till förvrängning av lunganatomi. Häri beskriver vi en billig metod för luft-inflation under vaskulär perfusion-fixering för att bevara morfologi och plats för luftvägarna och alveolar celler och interstitium i murin lungor för nedströms histologic studier. Konstant lufttryck levereras till lungorna via luftstrupen från en förseglad, luftfylld kammare som upprätthåller trycket via en justerbar vätskekolonn medan fixeringen genomsyras genom rätt ventrikel.
Introduction
Lung histologi representerar guldstandarden för att bedöma lungarkitektur under hälsa och sjukdom och är ett av de vanligaste verktygen av lungforskare1. En av de mest kritiska aspekterna av denna teknik är korrekt isolering och bevarande av lungvävnad, eftersom variation i detta steg kan leda till dålig vävnadskvalitet och felaktiga resultat1,2,3. Hos levande djur bestäms lungvolymen av balansen mellan inåtgående elastisk rekyl i lungan och yttre krafter som överförs från bröstväggen och membranet genom ytspänning. Följaktligen, när bröstkorgen är in, går yttre krafter förlorade och lungan kollapsar. Histologic delar upp förberett från kollapsade lungor har ett trångt utseendemässigt och gränser mellan anatomic kupéer (dvs. luftrum, vasculature, och interstitium) kan vara svåra att skilja. För att kringgå denna utmaning blåser forskare ofta upp lungorna under kemisk fixering så att luftrumsstorlek och arkitektur upprätthålls.
Lungor kan blåsas upp med luft eller vätska. Det tryck som krävs för att blåsa upp lungorna till samma volym skiljer sig mellan luft- och vätskeinflation på grund av intermolecular krafter vid luft-flytande gränssnittet. Högre tryck (t.ex. 25 cmH2O) krävs vid luftinflation än flytande inflation (t.ex. 12 cmH2O) för att övervinna ytspänningen och öppna den kollapsade alveol4. När alveoli har rekryterats kan ett lägre tryck hålla alveolerna öppna för samma volym som tryckvolymkurvplatåerna, och trycket utjämnas i hela lungan enligt Pascals lag4,5,6,7,8.
Två huvudsakliga metoder för lunginflation och fixering finns för att bevara murin lungor för histologi. Oftast är luftrumen ingjutna med vätska – ofta innehållande ett fixativ. Den största fördelen med detta tillvägagångssätt är att det är relativt enkelt och kräver lite träning. Medan intratrakeal instillation av fixativ kan föredras i studier som fokuserar på vaskulaturen, tenderar vätska som ingjuts via luftstrupen att trycka proximala luftvägsceller och muciner i mer distala luftrumsregioner medan luftinflationeninte 1,3,4,9,10,11. Dessutom förändrar oavsiktlig avskildhet av leukocyter från epitel under flytande inflation deras morfologi, artefaktuellt ger dem ett enkelt, rundat utseende4,10,11,12. Slutligen kan inflationen av lungorna med vätska oavsiktligt komprimera interstitium4,10,11. Tillsammans kan dessa faktorer förvränga den normala anatomin och cellfördelningen i de bevarade lungorna, vilket begränsar tekniken.
En alternativ metod för vävnad bevarande är vaskulär perfusion-fixering. I denna metod perfused fixativ i pulmonell vaskulatur via vena cava eller rätt ventrikel. Denna metod bevarar placeringen och morfologin hos celler i luftrummets lumen. Men om inte lungorna är uppblåsta under perfusion-fixering, lungvävnaden kommer sannolikt att kollapsa.
Luft-inflation med vaskulär perfusion-fixering utnyttjar styrkor från var och en av ovanstående fixering tekniker. Häri tillhandahåller vi ett protokoll för denna teknik. De material och den utrustning som krävs är relativt billiga och kan enkelt erhållas och monteras. Den färdiga installationen, som visas i figur 1A, ger konstant luftvägstryck till lungorna genom en justerbar, vätskefylld kolonn medan en peristaltisk pump levererar fixativ via rätt ventrikel. Lungor med bevarad morfologi kan sedan bearbetas vidare för strukturfunktionsanalyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om ofta används, intratrakeal-baserade fixering metoder förskjuta leukocyter från luftvägarna och kan ändra normala lung arkitektur. Metoden för luft-inflation med vaskulär perfusion-fixering som tillhandahålls i detta protokoll övervinner dessa fallgropar och mer exakt bevarar lunganatomi. Nycklarna till att få högkvalitativ vävnad från kärlperfusion-fixeringsmetoden inkluderar noggrann övervakning av luft-inflation tryck, undvika luftläckor och säkerställa adekvat perfusion av fixativ i vaskulat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) beviljar HL140039 och HL130938. Författarna vill tacka Shannon Hott och Jazalle McClendon för deras tekniska expertis.
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S. Pressure-Volume Curves of the Respiratory System. Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. a. T., Henricks, P. a. J., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. Airway Macrophages. American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).
