Vasküler Perfüzyon-Fiksasyon ile Murine Akciğerlerinin Hava-Enflasyonu
Summary
Sunulan, yapı-fonksiyon analizleri için hava yolları, alveoller ve intersityum içindeki hücrelerin yerini koruyan akciğerlerin vasküler perfüzyon-fiksasyonu ile hava şişirme için bir yöntemdir. Sabit hava yolu basıncı bir hava şişirme odası ile korunurken, fiksatif sağ ventrikülden perfüzyon yapılır. Akciğerler histolojik çalışmalar için işlenir.
Abstract
Akciğer histolojisi genellikle akciğer homeostazı ve hastalık patogenez sırasında hava sahası hücrelerinin sağladığı katkıları araştırmak için kullanılır. Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılan aşılama tabanlı fiksasyon yöntemleri hava sahası hücrelerini ve mukusu terminal hava yollarına yer değiştirebilir ve doku morfolojisini değiştirebilir. Buna karşılık, vasküler perfüzyon-fiksasyon teknikleri, hava sahalarındaki hücrelerin yerini ve morfolojisini ve mukozal astarı korumada üstündür. Bununla birlikte, pozitif hava yolu basıncı aynı anda uygulanmazsa, akciğerlerin bölgeleri çökebilir ve kılcal damarlar alveolar boşluklara şişerek akciğer anatomisinin bozulmasına yol açabilir. Burada, aşağı akış histolojik çalışmaları için murine akciğerlerde hava yolu ve alveolar hücrelerin ve intersteyumun morfolojisini ve yerini korumak için vasküler perfüzyon-fiksasyon sırasında hava enflasyonu için ucuz bir yöntem tarif ediyoruz. Sabit hava basıncı, sağ ventrikülden sabitlenmişken ayarlanabilir bir sıvı kolon aracılığıyla basıncı koruyan kapalı, hava dolu bir odadan nefes borusu yoluyla akciğerlere iletilir.
Introduction
Akciğer histolojisi, sağlık ve hastalık sırasında akciğer mimarisini değerlendirmek için altın standardı temsil eder ve pulmoner araştırmacılar tarafından en sık kullanılan araçlardan biridir1. Bu tekniğin en kritik yönlerinden biri akciğer dokusunun uygun izolasyonu ve korunmasıdır, çünkü bu adımdaki değişkenlik düşük doku kalitesine ve hatalı sonuçlara yol açabilir1,2,3. Canlı hayvanlarda akciğer hacmi, akciğerin içe elastik geri tepmesi ile göğüs duvarından ve diyaframdan yüzey gerilimi ile iletilen dışa doğru kuvvetler arasındaki denge ile belirlenir. Buna göre, toraks girildiğinde dışa doğru kuvvetler kaybolur ve akciğer çöker. Çökmüş akciğerlerden hazırlanan histolojik bölümlerin kalabalık bir görünüme sahip olması ve anatomik bölmeler (yani hava sahaları, vaskülatür ve intersitium) arasındaki sınırları ayırt etmek zor olabilir. Bu zorluğu atlatmak için araştırmacılar genellikle kimyasal fiksasyon sırasında akciğerleri şişirir, böylece hava sahası büyüklüğü ve mimarisi korunur.
Akciğerler hava veya sıvı ile şişirilebilir. Akciğerleri aynı hacme şişirmek için gereken basınç, hava-sıvı arasayıslarındaki intermoleküler kuvvetler nedeniyle hava ve sıvı-şişirme arasında farklılık gösterir. Yüzey geriliminin üstesinden gelmek ve çökenalveolleri açmak için hava enflasyonu sırasında sıvı enflasyonundan (örneğin, 12 cmH 2 O) daha yüksek basınç (örneğin,25cmH2O) gereklidir. Alveoller işe alındıktan sonra, daha düşük bir basınç alveolleri basınç hacmi eğri platolarıyla aynı hacme açık tutabilir ve pascal yasasına göre basınçlar akciğer boyunca eşitleşir4, 5,6,7,8.
Histoloji için murine akciğerleri korumak için iki ana akciğer şişirme ve fiksasyon yöntemi mevcuttur. En yaygın olarak, hava sahaları sıvı ile aşılanır – genellikle bir fiksatif içerir. Bu yaklaşımın temel avantajı, nispeten kolay olması ve çok az eğitim gerektirmeleridir. Vaskülasyona odaklanan çalışmalarda fiksatifin intratrakiel olarak aşılanması tercih edilebilirken, trakea yoluyla aşılanan sıvı proksimal hava yolu hücrelerini ve mücinleri daha distal hava sahası bölgelerine itme eğilimindedirken, hava enflasyonu 1 ,3,4,9,10,11değildir. Ayrıca, sıvı şişirme sırasında lökositlerin epitelden yanlışlıkla ayrışması morfolojilerini değiştirir, artifactually onlara basit, yuvarlak bir görünüm verir4,10,11,12. Son olarak, akciğerlerin sıvı ile şişirilmesi istemeden intersitium4,10,11sıkıştırabilir. Birlikte, bu faktörler korunmuş akciğerlerdeki normal anatomiyi ve hücresel dağılımları bozabilir, böylece tekniği sınırlayabilir.
Doku korumanın alternatif bir yöntemi vasküler perfüzyon-fiksasyondur. Bu yöntemde, fiksatif vena kava veya sağ ventrikül yoluyla pulmoner vaskülasyona perfüzyon yapılır. Bu yöntem, hava sahası lümeninde hücrelerin konumunu ve morfolojisini korur. Bununla birlikte, perfüzyon-fiksasyon sırasında akciğerler şişirilmedikçe, akciğer dokusunun çökmesi muhtemeldir.
Vasküler perfüzyon-fiksasyon ile hava şişirme, yukarıdaki fiksasyon tekniklerinin her birinden güçlü yönler sağlar. Burada bu teknik için bir protokol sunuyoruz. Gerekli olan malzeme ve ekipmanlar nispeten ucuzdur ve kolayca elde edilebilir ve monte edilebilir. Şekil 1A’dagösterilen tamamlanmış kurulum, ayarlanabilir, sıvı dolu bir kolon aracılığıyla akciğerlere sabit hava yolu basıncı sağlarken, peristaltik bir pompa sağ ventrikül yoluyla fiksatif sağlar. Korunmuş morfolojiye sahip akciğerler daha sonra yapı fonksiyon analizleri için daha fazla işlenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yaygın olarak kullanılmasına rağmen, intratrakial bazlı fiksasyon yöntemleri lökositleri hava yollarından ayırır ve normal akciğer mimarisini değiştirebilir. Bu protokolde sağlanan damar perfüzyonu-fiksasyonu ile hava-şişirme yöntemi bu tuzakların üstesinden gelmekte ve akciğer anatomisini daha doğru bir şekilde korumamaktadır. Vasküler perfüzyon-fiksasyon yönteminden yüksek kaliteli doku elde etmenin anahtarları arasında hava-şişirme basınçlarının dikkatli bir şekilde izlenmesi, hava…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) tarafından HL140039 ve HL130938 hibeleri tarafından finanse edildi. Yazarlar Shannon Hott ve Jazalle McClendon’a teknik uzmanlıkları için teşekkür eder.
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S. Pressure-Volume Curves of the Respiratory System. Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. a. T., Henricks, P. a. J., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. Airway Macrophages. American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).
