न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियां डिस्जेनिवली माइक्रोग्लिया कार्यों से जुड़ी होती हैं। यह लेख आईपीएससी-मैक्रोफेज द्वारा न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं के फागोसिटोसिस की इन विट्रो परख को रेखांकित करता है। क्वांटिटेटिव माइक्रोस्कोपी रीडआउट्स को लाइव-सेल टाइम-लैप्स इमेजिंग और फिक्स्ड-सेल हाई-कंटेंट इमेजिंग दोनों के लिए वर्णित किया गया है ।
माइक्रोग्लिया ने पार्किंसंस रोग और अल्जाइमर रोग सहित कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में न्यूरोइम्यून प्रतिक्रियाओं को आर्केस्ट्रा किया। माइक्रोग्लिया एफेरोसाइटोसिस की प्रक्रिया के माध्यम से मृत और मरने वाले न्यूरॉन्स को साफ करता है, जो फागोसिटोसिस का एक विशेष रूप है। फागोसिटोसिस फ़ंक्शन को पर्यावरण या आनुवंशिक जोखिम कारकों द्वारा बाधित किया जा सकता है जो माइक्रोग्लिया को प्रभावित करते हैं। यह पेपर एक मानव न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइन (एसएच-SY5Y) का उपयोग करके माइक्रोग्लिया के एक प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) मॉडल में माइक्रोग्लियल एफेरोसाइटोसिस का अध्ययन करने के लिए एक तेजी से और सरल इन विट्रो माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो फागोसिटिक कार्गो के लिए पीएच-संवेदनशील डाई के साथ लेबल किया जाता है। प्रक्रिया के परिणामस्वरूप मृत न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं की उच्च उपज होती है, जो सतह फॉस्फेटिडिलसेरीन प्रदर्शित करती है, जिसे फागोसाइट्स द्वारा “ईट-मी” संकेत के रूप में मान्यता प्राप्त है। 96-अच्छी तरह से प्लेट परख लाइव-सेल समय-चूक इमेजिंग के लिए उपयुक्त है, या प्लेट को उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी द्वारा आगे के प्रसंस्करण और मात्रात्मक से पहले सफलतापूर्वक तय किया जा सकता है। फिक्स्ड-सेल उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी छोटे अणु अवरोधकों की स्क्रीनिंग या आनुवंशिक संस्करण आईपीएससी लाइनों के फैगोसाइटिक कार्य का आकलन करने के लिए परख को बढ़ाया जा करने में सक्षम बनाता है। हालांकि इस परख को आईपीएससी-मैक्रोफेज द्वारा पूरे मृत न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं के फागोसिटोसिस का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था, परख को आसानी से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों, जैसे सिनेप्टोसोम और मायलिन, और अन्य फागोसिटिक सेल प्रकारों के लिए प्रासंगिक अन्य कार्गो के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
माइक्रोग्लिया मस्तिष्क ऊतक-निवासी मैक्रोफेज हैं, और उनके कार्यों में प्रतिरक्षा निगरानी, चोट/संक्रमण, सिनेप्टिक रीमॉडलिंग, और मृत कोशिकाओं, मायलिन, प्रोटीन समुच्चय और रोगजनकों के फागोसाइटोसिस के लिए भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का समन्वय शामिल है। फागोसाइटोसिस वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा माइक्रोग्लिया सतह रिसेप्टर्स के साथ कार्गो को पहचानते हैं और वस्तु को एक फागोसोम में निगलने के लिए अपने साइटोस्केलेटन को पुनर्गठित करते हैं, जो तब कार्गो के क्षरण के लिए लाइसोसोम के साथ फ़्यूज़ करता है। स्वस्थ माइक्रोग्लिया फैगोसाइटोज़ एपोटोटिक मस्तिष्क कोशिकाओं को परिगलित1 बननेसे पहले उन्हें हटाने के लिए । एपोसाइटिक कोशिकाओं के फागोसिटोसिस को एफेरोसाइटोसिस के रूप में भी जाना जाता है, और मरने वाले सेल2द्वारा फॉस्फेटिडिलसेरीन “ईट-मी” सिग्नल के प्रदर्शन की आवश्यकता होती है। कई माइक्रोग्लिया रिसेप्टर्स सीधे टिम-4, बाई1, स्टैब्लिलिन-2 और ट्रेम2 सहित फॉस्फेटिडिलसेरीन को बांधते हैं। माइक्रोग्लियल टैम रिसेप्टर्स (जैसे, MERTK) और इंटीग्रीन अप्रत्यक्ष रूप से क्रमशः सहायक प्रोटीन GAS6 या MFG-E8 का उपयोग करके फॉस्फेटिडिलसेरीन को बांधते हैं। अन्य “खाओ-मुझे” संकेत मरने वाली कोशिकाओं की मान्यता के लिए आवश्यक हो सकते हैं, इनमें ग्लाइकोसिलेशन या सतह प्रोटीन के प्रभार में परिवर्तन शामिल हैं; कोशिका की सतह पर इंट्रासेलुलर प्रोटीन ICAM3, कैल्टेटिकुलिन, एनेक्सिन-I की अभिव्यक्ति; ऑक्सीकृत एलडीएल; या माइक्रोग्लिया द्वारा एपोटोटिक सेल की कोटिंग-उत्पादित पूरक C1q1,2.
पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग, फ्रंटोटेम्पोरल डिमेंशिया, और एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस सहित न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियां माइक्रोग्लिया फ़ंक्शन के लिए हानि के साथ जुड़ी हुई हैं, जिसमें मृत कोशिकाओं, माइलिन के टुकड़े और प्रोटीन समुच्चय जैसे मस्तिष्क अपशिष्ट उत्पादों का संचय शामिल है, और इन उत्तेजनाओं के लिए अतिरंजित भड़काऊ प्रतिक्रियाएं शामिल हैं3। फागोसिटोसिस न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में बिगड़ा हो सकता है और उम्र बढ़ने, सूजन, या विशिष्ट आनुवंशिक जोखिम वेरिएंट4,5के संयोजन के कारण विकृति में योगदान देता है। दूसरी ओर, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के पशु मॉडलों से भी सबूत हैं कि माइक्रोग्लिया अनुपयुक्त रूप से व्यवहार्य न्यूरॉन्स या सिनेप्स6,7,8हो सकता है। इस तंत्र को क्षतिग्रस्त न्यूराइट्स के फॉस्फेटिलसेरीन डिस्प्ले द्वारा उकसाया जा सकता है, जो सीधे माइक्रोग्लिगल फैगोसाइटोसिस रिसेप्टर्स TREM2 या GPR56 द्वारा महसूस किया जाता है, या अप्रत्यक्ष रूप से घुलनशील पूरक C1q द्वारा महसूस किया जाता है जो फॉस्फेटिडिलसेरीन-समृद्ध झिल्ली को लेते हैं, जिससे सीआर 3-मीडियाटेड फैगोसाइटोसिस9,10,11।
फागोसिटोसिस फ़ंक्शन के विट्रो परख में, उदाहरण के लिए, माइक्रोग्लिया में आनुवंशिक जोखिम संस्करण के फेनोटाइपिक प्रभाव का आकलन करने के लिए, अक्सर लेटेक्स मोतियों 4 जैसे गैर-शारीरिक कार्गो का उपयोग करके कियाजाताहै। फ्लोरोसेंटली लेबल बैक्टीरिया और जाइमोसन का भी उपयोग किया जाता है, जो शारीरिक होते हैं लेकिन न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के लिए प्रासंगिक नहीं होते हैं। गैर-शारीरिक फैगोसाइटिक कार्गो का उपयोग फागोसिटिक चपेट की बुनियादी मशीनरी में दोषों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है लेकिन एपोसाइटिक न्यूरॉन्स के फैगोसाइटोसिस में पहले “मान्यता” कदम को सही ढंग से मॉडल करने में विफल रहता है। आकार, आकार, कठोरता और कार्गो का प्रकार भी सक्रिय होने वाले इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग रास्तों को निर्देशित करता है, जिससे माइक्रोग्लिया सक्रियण राज्य के विभिन्न परिणाम होते हैं। उदाहरण के लिए, ई कोलाई बैक्टीरिया छोटे और कठोर होते हैं, मानव कोशिकाओं के विपरीत, और उनकी सतह पर लिपोपॉलिसाकराइड्स टोल-जैसे रिसेप्टर 4 (टीएलआर 4) द्वारा पहचाने जाते हैं जो फैगोसाइटोसिस और प्रो-भड़काऊ सिग्नलिंगपाथवे 2,12को सक्रिय करता है।
न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग अध्ययनों के संदर्भ में, एक अधिक प्रासंगिक फैगोसाइटिक कार्गो में स्तनधारी प्लाज्मा झिल्ली पर फॉस्फेटिडिलसेरिन डिस्प्ले होगा, और आदर्श रूप से मानव और न्यूरोनल होगा, जिसमें उन संकेतों को शामिल किया जाएगा जो माइक्रोग्लिया का सामना करने की संभावना है। इस फागोसिटोसिस प्रोटोकॉल के लिए, मानव न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइन एसएच-SY5Y को एक न्यूरॉन मॉडल के रूप में चुना गया था जो संस्कृति के लिए आसान है। स्थायी सतह फॉस्फेटिडिलसेरीन डिस्प्ले कृत्रिम रूप से पैराफॉर्मलडिहाइड द्वारा प्रेरित किया गया था, जिसे पहले प्लेटलेट्स13के फॉस्फेटिडिलसेरीन डिस्प्ले का कारण दिखाया गया है। माइक्रोग्लिया सेल मॉडल के लिए मानव आईपीएससी-मैक्रोफेज का उपयोग किया गया था, जो मानव माइक्रोग्लिया के ओनोंजेनी और ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल की नकल करते हैं, और फैगोसाइटिक रूप से सक्षम14,15,16,17हैं। आईपीएससी-मैक्रोफेज सबसे प्रामाणिक माइक्रोग्लिया मॉडल उपलब्ध नहीं हैं, उदाहरण के लिए, वे माइक्रोग्लिया आकृति विज्ञान की नकल नहीं करते हैं; हालांकि, एक यह माइक्रोग्लिया के एक अधिक प्रामाणिक मोनोकल्चर आईपीएससी मॉडल के लिए स्थानापन्न कर सकते है अगर वांछित, जैसे Haenseler एट अल15. मानव आईपीएससी मॉडल न्यूरोडिजनरेशन का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक कृंतक माइक्रोग्लिया के लिए बेहतर हैं, मानव बनाम माउस न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग ऊतकों में मनाए गए माइक्रोग्लिया ट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूल के सीमित ओवरलैप के बारे में चिंताओं के कारण18। मृत एसएच-SY5Ys एक एसिड के प्रति संवेदनशील डाई से सना हुआ है जो तटस्थ पीएच पर कमजोर और फागोसाइटोसिस के बाद आईपीएससी-मैक्रोफेज के फैगोलिसोसोम के अंदर अधिक दृढ़ता से फ्लोरेस्सी करता है। एसिड-सेंसिटिव डाई का उपयोग करने से फागोसिटिक घटनाओं का पता लगाने की सटीकता में सुधार होता है, जिसमें जीवित और फिक्स्ड मैक्रोफेज19के विभिन्न रीडआउट्स के लिए बहुमुखी प्रतिभा होती है। यह प्रोटोकॉल फिगोसाइटोसिस के लाइव-सेल समय-चूक इमेजिंग दोनों को रेखांकित करता है, और फागोसिटोसिस के लिए एक निश्चित उच्च सामग्री इमेजिंग परख, रीडआउट(चित्रा 1)से पहले एक ही सेल तैयारी चरणों के साथ।
चित्रा 1:कार्यप्रणाली का योजनाबद्ध आरेख। फैगोसाइटोसिस परख की रूपरेखा, जहां एसएच-SY5Ys की तैयारी और आईपीएससी-मैक्रोफेज का धुंधला समानांतर रूप से किया जाता है, और फिर एसएच-SY5Ys को आईपीएससी-मैक्रोफेज पर पिपेट किया जाता है। या तो लाइव-सेल टाइम-लैप्स इमेजिंग तुरंत की जाती है, या कोशिकाओं को आवश्यक अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटेड कियाजाता है और उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी करने से पहले तय किया जाता है । पीएफए: पैराफॉर्मलडिहाइड, एचबीएम: फिनोल रेड-फ्री एचईपी-बफर्ड मीडिया, पीएचआर: पीएच-संवेदनशील रेड फ्लोरोसेंट डाई एसटीपी एस्टर सॉल्यूशन, पीआरएफएम: फिनॉल रेड-फ्री मैक्रोफेज मीडिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
माइक्रोग्लिया में महत्वपूर्ण कार्य होते हैं जो न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की दीक्षा और प्रगति को प्रभावित करते हैं, जिसमें एपोटोटिक न्यूरॉन्स के फागोसिटोसिस शामिल हैं। बिगड़ा माइक्रोग्लियल फागोसिटोसिस और सिनेप्सेस के अनुचित फागोसिटोसिस दोनों न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से जुड़े हुए हैं, हालांकि अंतर्निहित तंत्र और करणीय संबंध अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं4,23। यह पेपर आईपीएससी-मैक्रोफेज द्वारा एपोटोटिक कोशिकाओं के फागोसिटोसिस को मापने के लिए एक फागोसिटोसिस को रेखांकित करता है, या तो लाइव-सेल समय-चूक इमेजिंग रीडआउट या फिक्स्ड-सेल हाई-कंटेंट माइक्रोस्कोपी, या एक ही परख पर दोनों का संयोजन। इस बहुमुखी प्रतिभा का मतलब है कि परख का उपयोग कुछ कुओं में समय के साथ व्यक्तिगत फेगोसाइटिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है या कई शर्तों या उपचारों के साथ उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जा सकता है। चूंकि उच्च सामग्री परख एक ही समय बिंदु पर तय की जाती है, इसलिए एक साथ कई परख प्लेटें तैयार की जा सकती हैं। उच्च सामग्री परख रोग से जुड़े आनुवंशिक वेरिएंट के साथ मैक्रोफेज/माइक्रोग्लिया की विशेषता या phagocytosis में परिवर्तन के लिए छोटे अणु अवरोधकों स्क्रीनिंग के लिए संभावित उपयोगिता है । परख को अन्य माइक्रोग्लिया मॉडल, या संभावित एस्ट्रोसाइट्स के फागोसिटोसिस का अध्ययन करने के लिए भी आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। फागोसिटोसिस परख को संभावित रूप से लाइव-सेल इमेजिंग दाग के साथ मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया, कैल्शियम, या आरओएस संकेतक, और प्रोटीन के लिए पोस्ट-फिक्सेशन इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला किया जा सकता है। मौजूदा फैगोसाइटोसिस परख के साथ तुलना में जो एपोप्टोटिक न्यूरोनल कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, मुख्य लाभ जो इस प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं वह यह है कि फैगोसाइटिक कार्गो की तैयारी अपेक्षाकृत सरल और तेजी से होती है, और परिणामस्वरूप एक समान उत्पाद होता है। अन्य परखें 2घंटे25 के लिए एस-नाइट्रोसो-एल-सिस्टीन के साथ न्यूरॉन्स या एसएच-SY5Ys के एपोप्टोसिस को प्रेरित करती हैं, 3 एच22के लिए ओकाडाइक एसिड, स्टैरोस्पोरीन 4-16 एच26, 27,28, 29यायूवी-विकिरण के लिए 24 एच30के लिए, और इसके परिणामस्वरूप एपोप्टोसिस के विभिन्न चरणों में कोशिकाएं हो सकती हैं। इसके अलावा, लाइव-सेल इमेजिंग और उच्च सामग्री इमेजिंग readouts पहले वर्णित नहीं किया गया है, जहां तक लेखकों को पता है । फैगोसाइटिक कार्गो तैयार करने के लिए पैराफॉर्मेल्डिहाइड-फिक्सेशन का उपयोग करने की मुख्य सीमा यह है कि यह एपोप्टोसिस की प्रक्रिया को पूरी तरह से पुनः रीकैपिटल नहीं करता है, क्योंकि निर्धारण कोशिकाओं को एपोप्टिक निकायों में विभाजित होने से रोकता है, जो उनके छोटे आकार के कारण अधिक तेजी से फेगोसाइटो होने की संभावना है। यह ज्ञात नहीं है कि न्यूक्लियोटाइड के स्राव पर क्या प्रभाव निर्धारण होता है “मुझे ढूंढें” संकेत (उदाहरण के लिए, एटीपी, यूडीपी) लक्ष्य कोशिका से जो phagocytes को आकर्षित करते हैं। एपोप्टोटिक कोशिकाओं के समान, फिक्स्ड एसएच-SY5Ys प्रोपिडियम आयोडाइड के लिए कुछ झिल्ली पारगम्यता प्रदर्शित करता है। झिल्ली पार पारियक्षा “मुझे खोजें” संकेतों की रिहाई से जुड़ी हुई है; हालांकि, यह तय एसएच-SY5Ys में अध्ययन नहीं किया गया है, और अगर न्यूक्लियोटाइड भी जल्दी जारी कर रहे हैं, वे दूर बह जाएगा इससे पहले कि एसएच-SY5Ys आईपीएससी-मैक्रोफेज में जोड़ रहे हैं ।
प्रोटोकॉल में पहला महत्वपूर्ण कदम एक पीएच-संवेदनशील लाल फ्लोरोसेंट डाई के एक एसटीपी एस्टर के साथ मृत एसएच-SY5Ys का धुंधला है। यह डाई तेजी से और सहसंयोजक रूप से मृत एसएच-SY5Ys की सतह पर मुफ्त प्राथमिक अमीनों के साथ प्रतिक्रिया करता है। धुंधला होने की अवधि को अनुकूलित करने की आवश्यकता नहीं है; हालांकि, लेबलिंग से पहले डाई को संभालने के साथ देखभाल की जानी चाहिए। लेबलिंग प्रतिक्रिया मुक्त अमीनों युक्त बफ़र्स में नहीं किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यदि डीएमएसओ स्टॉक ठंडे जलीय बफर या उच्च अंतिम एकाग्रता में पतला हो जाता है तो वर्षा का खतरा होता है। अपरिपक्वता माइक्रोस्कोप के नीचे घने अंधेरे वस्तुओं के रूप में दिखाई देगी। इसके अतिरिक्त, पीएच-संवेदनशील डाई समाधान नियमित प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूबों से चिपक जाता है और धीरे-धीरे धोता है; इसलिए, लेबलिंग चरण के लिए कम बाध्यकारी ट्यूबों की सिफारिश की जाती है। एक पीएच-संवेदनशील डाई का उपयोग, स्थायी रूप से फ्लोरोसेंट डाई के बजाय, घिरा हुआ कणों की पहचान को एड्स करता है, बनाम कण जो प्लाज्मा झिल्ली को पड़ोसी करते हैं। चूंकि तटस्थ पीएच पर कुछ फ्लोरेसेंस है, इसलिए फागोसाइटिक कार्गो और आईपीएससी-मैक्रोफेज के घनत्व को सटीक विभाजन के लिए पर्याप्त कम रखा जाना चाहिए, हालांकि काफी अधिक है कि कई फैगोसाइटिक घटनाओं पर कब्जा कर लिया जाता है। उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी कुएं में कार्गो के मध्यम घनत्व के साथ फागोसिटोसिस की सटीक पहचान करने में सक्षम थी (2 एसएच-SY5Ys प्रति आईपीएससी-मैक्रोफेज) । इसके विपरीत, गहरे लाल स्पेक्ट्रम में माइक्रोस्कोप की कमजोर संवेदनशीलता के कारण, लाइव-सेल समय-चूक इमेजिंग डेटा में आईपीएससी-मैक्रोफेज का विभाजन कम आत्मविश्वास से लबरेज था और झूठी सकारात्मक (हर दो आईपीएससी-मैक्रोफेज के लिए 1 एसएच-SY5Y) की संभावना को कम करने के लिए कार्गो के बहुत कम घनत्व का उपयोग करना आवश्यक था। अनुपचारित और साइटोचलासिन डी-इलाज कुओं के बीच तुलना के साथ उचित विभाजन और कार्गो घनत्व का सत्यापन किया जाना चाहिए। एक अच्छी तरह से अनुकूलित परख में, साइटोचलासिन डी को अनुपचारित नमूनों के सापेक्ष प्रति सेल स्पॉट की औसत संख्या को 90% तक कम करना चाहिए।
प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम आईपीएससी-मैक्रोफेज धुंधला है, जो सेल की पहचान करने और छवि विश्लेषण में खंडित करने की अनुमति देता है ताकि किसी भी बाहरी एसएच-SY5Ys को गिनती से बाहर रखा जा सके। अनुशंसित डाई सेल-पार्टेंट है, जो साइटोप्लाज्म, फिक्सेबल और गैर-विषाक्त (सामग्रियों की तालिका देखें) के भीतर एक अघुलनशील फ्लोरोसेंट उत्पाद में परिवर्तित हो जाता है। उच्च सामग्री इमेजिंग फैगोसाइटोसिस परख के साथ आईपीएससी-मैक्रोफेज के उपयोग के लिए धुंधला कदम अनुकूलित किया गया था, और हमारा सुझाव है कि यदि अन्य सेल प्रकारों का उपयोग किया जाता है तो इसे फिर से अनुकूलित किया जाना चाहिए। कोशिकाओं के भीतर अघुलनशील फ्लोरोसेंट उत्पाद के जमाव में सुधार करने के लिए कोशिका धुंधला की अवधि को बढ़ाया जा सकता है। यदि डाई एकाग्रता अनुकूलित है, तो कार्बनिक विलायक वाहन के जहरीले स्तर से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
परख की सफलता के लिए तीसरा महत्वपूर्ण कारक डेटा विश्लेषण है। प्रदान की गई विश्लेषण पाइपलाइनों का उद्देश्य आदेशात्मक के बजाय मार्गदर्शन का होना है, क्योंकि तीव्रता या सेल आकृति विज्ञान को धुंधला करने के मतभेद लिखित पाइपलाइनों के विभाजन की प्रभावशीलता को कम कर सकते हैं। इसलिए उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों पर पाइपलाइन के परीक्षण के साथ कुछ अनुकूलन की आवश्यकता होगी, और जिन मापदंडों को अनुकूलित किया जाना चाहिए, वे प्रोटोकॉल पाठ में इंगित किए जाते हैं। नकारात्मक नियंत्रणों में एक ऐसी स्थिति शामिल होनी चाहिए जहां आईपीएससी-मैक्रोफेज को एसएच-SY5Ys के अलावा से पहले साइटोचलासिन डी जैसे शक्तिशाली फैगोसाइटोसिस अवरोधक के साथ पूर्व-इलाज किया जाता है। एक और संभव नकारात्मक नियंत्रण एसएच-SY5Ys के अलावा परख के अंत में आईपीएससी-मैक्रोफेज के पहले अनुपचारित कुओं के लिए है, निर्धारण से पहले 10 मिनट, जो कार्गो के कुछ बसने की अनुमति देता है, लेकिन phagocytosis की एक प्रशंसनीय मात्रा के लिए बहुत कम है । एक फागोसिटोसिस घटना को आईपीएससी-मैक्रोफेज की सीमाओं के भीतर एक लाल फ्लोरोसेंट वस्तु के रूप में परिभाषित किया गया है, जिसे डीप रेड फ्लोरेसेंस चैनल का उपयोग करके सॉफ्टवेयर एल्गोरिदम द्वारा परिभाषित किया गया है। यदि कोशिकाओं का विभाजन खराब है(चित्रा 2),तो आईपीएससी-मैक्रोफेज के करीब निकटता में कई गैर-फैगोसाइटेड एसएच-SY5Ys को गलत तरीके से विश्लेषण में शामिल किया जा सकता है, यानी झूठी सकारात्मक। अच्छे विभाजन को प्राप्त करने में सबसे महत्वपूर्ण कारक आईपीएससी-मैक्रोफेज का कठोर चित्रण है। दोनों विश्लेषणों के लिए विभाजन स्वचालित है, इसलिए हर सेल के लिए सही विभाजन प्राप्त करना संभव नहीं है; हालांकि, कुछ मापदंडों को विभाजन को अधिक इष्टतम बनाने के लिए समायोजित किया जा सकता है, संदर्भ के रूप में कुछ परीक्षण छवियों का उपयोग करके। इष्टतम विभाजन का आकलन करने के लिए साइटोचलासिन डी नियंत्रण महत्वपूर्ण है क्योंकि इस स्थिति में पाई गई फैगोसाइटिक घटनाओं की एक उच्च संख्या इंगित करती है कि विभाजन उप-इष्टतम है। डेटा विश्लेषण पाइपलाइन का अनुकूलन आदर्श रूप से तब तक दोहराया जाना चाहिए जब तक कि साइटोचलासिन डी कंडीशन बनाम कोई अवरोधक में प्रति फैगोसाइटिक घटनाओं की संख्या 80%-90% कम न हो।
फैगोसाइटोसिस परख के साथ समस्याएं जो सबसे अधिक होने की संभावना है: (1) सकारात्मक नियंत्रणों में कमजोर पीएच-संवेदनशील फ्लोरेसेंस, (2) परख के अंत में मैक्रोफेज का विरल या असमान वितरण, या (3) गैर-फैगोसाइटोस्ड एसएच-SY5Ys से विश्लेषण में झूठी-सकारात्मक की उच्च संख्या। कमजोर पीएच-संवेदनशील फ्लोरेसेंस के समस्या निवारण को सबसे पहले यह जांचना चाहिए कि एसएच-SY5Ys के धुंधला होने के परिणामस्वरूप एक मजबूत मैजेंटा रंग के साथ एक सेल गोली हुई। यदि रंग कमजोर है, तो सुनिश्चित करें कि एक ताजा डाई स्टॉक का उपयोग किया जाता है, यह सुनिश्चित करें कि लेबलिंग बफर अमीन-मुक्त है, धुंधला होने से पहले एसएच-SY5Ys में एक अतिरिक्त धोने जोड़ें, जांच करें कि एसएच-SY5Ys की सही संख्या दाग रही है या नहीं, यह सुनिश्चित करें कि कोई डाई उपजी सबूत में नहीं हैं, और डाई की लेबलिंग एकाग्रता को अनुकूलित करें। यदि एसएच-SY5Ys दृढ़ता से दाग रहे हैं, तो जांच करें कि क्या परख प्लेट में जोड़ा गया एकाग्रता सही है, और यह सुनिश्चित करें कि आईपीएससी-मैक्रोफेज स्वस्थ हैं और बहुत पुराने नहीं हैं। दूसरे प्रकार के मुद्दे, असमान मैक्रोफेज वितरण, पिपटिंग के दौरान कोशिकाओं के नुकसान से परिणाम दे सकते हैं और संकीर्ण-बोर युक्तियों से बचने के लिए कोशिकाओं द्वारा अनुभवी पाइपिंग बलों को कम करने के लिए कदम उठाए जाने चाहिए। अगर समस्या बनी रहती है तो सेल-परमीट डाई के साथ आईपीएससी-मैक्रोफेज लोड करने के इनक्यूबेशन समय को कम करें। तीसरी समस्या, विश्लेषण में गैर-phagocytosed कणों के गलत समावेश के बारे में, इंगित करता है कि विश्लेषण पाइपलाइन के अधिक अनुकूलन की आवश्यकता है । समस्या निवारण सबसे पहले सेल विभाजन पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए और क्या सॉफ्टवेयर आसन्न वस्तुओं सहित है । जिन विशिष्ट मापदंडों को समायोजित किया जा सकता है, उन्हें प्रासंगिक चरणों के नीचे दिए गए नोटों में सुझाव दिया जाता है (लाइव-सेल समय-चूक विश्लेषण के लिए चरण 6.1.11-6.1.15 और उच्च सामग्री विश्लेषण के लिए चरण 6.2.4-6.2.8)। यदि सेल सेगमेंटेशन को और बेहतर नहीं बनाया जा सकता है, तो उच्च सामग्री विश्लेषण में एक अतिरिक्त कदम (चरण 6.2.8) है जिसमें अनुचित रूप से खंडित आईपीएससी-मैक्रोफेज शामिल नहीं हैं। इसके अलावा, आईपीएससी-मैक्रोफेज के भीतर पीएच-संवेदनशील फ्लोरेसेंस के स्वीकृत स्थानों को फ़िल्टर करने वाले मॉड्यूल को अनुकूलित किया जा सकता है, जिससे स्वीकृत वस्तुओं की सीमा तीव्रता में वृद्धि होती है, जिससे गैर-फैगोसाइटोस्ड एसएच-SY5Ys (लाइव-सेल समय-चूक विश्लेषण के लिए चरण 6.1.17) को बाहर करने में मदद मिलनी चाहिए, और उच्च सामग्री विश्लेषण के लिए चरण 6.2.11)।
हमने फैगोसाइटोसिस परख के लिए दो प्रकार के माइक्रोस्कोपी रीडआउट विकसित किए हैं कि प्रत्येक के फायदे और सीमाएं हैं। लाइव-सेल टाइम-लैप्स इमेजिंग में फैगोसाइटोसिस काइनेटिक्स के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करने के गुण हैं और उच्च सामग्री इमेजिंग प्लेटफार्मों की तुलना में अधिक व्यापक रूप से उपलब्ध है। अनुशंसित ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर माइक्रोस्कोप स्रोत के लिए नास्तिक है और इसका उपयोग लाइव-सेल समय-चूक क्षमता के साथ या बिना किसी अच्छी गुणवत्ता वाले फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ किया जा सकता है। लाइव-सेल इमेजिंग की मुख्य सीमा सीमित संवेदनशीलता और प्रकाशिकी है, जो आईपीएससी-मैक्रोफेज के अच्छे विभाजन का पता लगाना और प्रदर्शन करना अधिक चुनौतीपूर्ण बनाती है। इस सीमा को या तो आईपीएससी-मैक्रोफेज धुंधला की अवधि में वृद्धि करके, या यदि उपलब्ध हो तो अधिक संवेदनशील माइक्रोस्कोप पर स्विच करके कम किया जा सकता है। यदि उच्च सामग्री इमेजिंग इमेजिंग सिस्टम उपलब्ध है तो उच्च सामग्री इमेजिंग फैगोसाइटोसिस परख अनुशंसित रीडआउट है। उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम उच्च थ्रूपुट और अधिक विश्वसनीय डेटा को सक्षम करते हैं, जिससे इस परख का उपयोग स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है, जिसमें ≥0.7 के एक मजबूत जेड ‘को “प्रति सेल स्पॉट की संख्या”आउटपुट 20के लिए उम्मीद की जाएगी। लाइव-सेल टाइम-लैप्स विधि की तुलना में, उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी रीडआउट में उच्च संवेदनशीलता होती है, स्वचालन और गति की उच्च डिग्री होती है, अधिक कुओं और इमेजिंग क्षेत्रों को संसाधित किया जा सकता है, और उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल छवियां उत्पादित की जाती हैं। सेल सेगमेंटेशन अच्छी छवियों के साथ अधिक प्रभावी है, और विभाजन को उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा अतिरिक्त रूप से सहायता प्रदान की जाती है जो अत्यधिक अनियमित आकार की कोशिकाओं के लिए उपयुक्त अधिक सेल विभाजन विधियां प्रदान करता है। उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर ने ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर की तुलना में फैगोसाइटोसिस के अधिक मापदंडों की भी गणना की, जैसे कि फैगोसाइटिक कोशिकाओं का प्रतिशत। उच्च सामग्री फैगोसाइटोसिस परख की मुख्य सीमा इमेजिंग सिस्टम और विश्लेषण सॉफ्टवेयर की लागत और पहुंच में से एक है।
अंत में, इस पेपर में प्रस्तुत मात्रात्मक फैगोसाइटोसिस परख विट्रो में मृत न्यूरॉन्स के माइक्रोग्लिया फागोसिटोसिस मॉडलिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण है। माइक्रोग्लिया को आईपीएससी-मैक्रोफेज द्वारा मॉडलिंग किया जाता है और मृत न्यूरॉन्स पैराफॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड एसएच-SY5Ys द्वारा मॉडलिंग कर रहे हैं । हालांकि सबसे प्रामाणिक माइक्रोग्लिया और मृत/एपोप्टोटिक न्यूरॉन मॉडल प्रकाशित नहीं है, ये तैयार करने के लिए आसान कर रहे है और स्केलेबल । परख ही अत्यधिक बहुमुखी है, इमेजिंग readout विस्तृत के दो प्रकार के साथ, और यह क्षमता के लिए विभिंन माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज मोनोकल्चर मॉडल, या एक अलग सेल प्रकार के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित करने के लिए phagocytic कार्गो के रूप में कार्य किया है । उच्च सामग्री इमेजिंग readout मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए लाभप्रद है और फागोसिटोसिस के छोटे अणु मॉड्यूलर, या आईपीएससी-मैक्रोफेज में स्क्रीन आनुवंशिक वेरिएंट को बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, चूंकि उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम महंगे और डेटा-भारी हैं, इसलिए एक वैकल्पिक इमेजिंग रीडआउट को प्रोटोकॉल में लाइव-सेल टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोप का उपयोग करके शामिल किया गया है, जिसे जरूरत पड़ने पर किसी भी अच्छी गुणवत्ता वाले पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ वैल मिल्लर और डॉ सोहैब निजामी और उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी तक पहुंच के लिए डॉ डेनियल एबरर को धन्यवाद देते हैं । इसके अलावा, लेखकों परख विकास सलाह के लिए डॉ एम्मा मीड शुक्रिया अदा करते हैं, और श्रीमती कैथी ब्राउन iPSC समर्थन के लिए । इस काम को ऑक्सफोर्ड मार्टिन स्कूल एलसी0910-004 से जेम्स मार्टिन स्टेम सेल फैसिलिटी ऑक्सफोर्ड (एए.C.) को अतिरिक्त सहायता के साथ अल्जाइमर रिसर्च यूके ऑक्सफोर्ड ड्रग डिस्कवरी इंस्टीट्यूट (ARUK ODDI, अनुदान संदर्भ ARUK-2020DDI-OX) द्वारा समर्थित किया गया था; पार्किंसंस यूके (J-1403) से स्मारक ट्रस्ट डिस्कवरी पुरस्कार; एमआरसी डिमेंशिया प्लेटफॉर्म यूके स्टेम सेल नेटवर्क कैपिटल इक्विपमेंट MC_EX_MR/N50192X/1, पार्टनरशिप एमआर/N013255/1, और मोमेंटम MC_PC_16034 अवॉर्ड्स ।
15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 352096 | For centrifugation of cells |
2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes | |||
2-mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | Component of Factory media |
4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | J61899 | For fixation of cells |
6-well plate, tissue culture treated | |||
AggreWell-800 24-well plate | STEMCELL Technologies | 34815 | Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies |
Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit | Abcam | ab14085 | Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide. |
Automated cell counter | |||
Benchtop centrifuge | |||
Benchtop microcentrifuge | |||
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | 96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay |
CellProfiler software | Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0. | ||
CellTracker Deep Red dye | Thermo Fisher | C34565 | Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media. |
Class 2 laminar air flow safety cabinet | |||
CO2 gas bottle | Accessory for EVOS FL Auto | ||
CO2 incubator, set to 37°C and 5 % CO2 | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis System | Perkin Elmer | Columbus | Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments. |
Cytochalasin D | Cayman | 11330 | Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM. |
DMEM/F12 | Gibco | 11320074 | Component of SH-SY5Y media |
DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for CellTracker and pHrodo dyes |
EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher | AMF4300 | Live-cell time-lapse imaging microscope |
EVOS Light Cube CY5 | Thermo Fisher | AMEP4656 | Accessory for EVOS FL Auto |
EVOS Light Cube DAPI | Thermo Fisher | AMEP4650 | Accessory for EVOS FL Auto |
EVOS Light Cube RFP | Thermo Fisher | AMEP4652 | Accessory for EVOS FL Auto |
EVOS Onstage Incubator | Thermo Fisher | AMC1000 | Accessory for EVOS FL Auto |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | Component of SH-SY5Y media |
Flow cytometer | |||
Flow cytometry analysis software | |||
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413302 | hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-038 | Component of both Factory and Macrophage media |
HBSS | Lonza | BE 10-547F | Hank’s balanced salt solution for washing steps |
Human recombinant BMP4 | Gibco | PHC9534 | Component of Embryoid Body media |
Human recombinant IL-3 | Gibco | PHC0033 | Component of both Factory and Macrophage media |
Human recombinant SCF | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Component of Embryoid Body media |
Human recombinant VEGF | Gibco | PHC9394 | Component of Embryoid Body media |
Live Cell Imaging Solution | Thermo Fisher | A14291DJ | Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys |
Low protein binding 2 mL tubes | Eppendorf | 30108.132 | For staining SH-SY5Ys |
M-CSF | Thermo Fisher | PHC9501 | Component of both Factory and Macrophage media |
mTeSR1 Medium | STEMCELL Technologies | 85850 | iPSC media |
Multichannel 20-200 uL pipette | For liquid handling of 96-well plate | ||
NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher | R37605 | Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media. |
Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | HH14000000 | High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9. |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media |
pHrodo iFL Red STP-Ester | Thermo Fisher | P36011 | pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution. |
Serological pipette filler | |||
T175 flask, tissue culture treated | Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories" | ||
T75 flask | Vessel for SH-SY5Y culture | ||
Transparent plate sealers | Greiner Bio-One | 676001 | For assay plate storage and transportation |
TrypLE Express (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat. |
Water bath, set to 37°C | |||
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red | Lonza | BE04-418F | Component of Factory and Macrophage media |
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red | Lonza | 04-744Q | Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors |