Isolering og kultur av residente hjertemakrofager fra Murine Sinoatrial og Atrioventrikulær node
Summary
Protokollen som presenteres her gir en trinnvis tilnærming for isolering av hjertebeboermakrofager fra sinoatrialnoden (SAN) og atrioventrikulære node (AVN) -regionen av musehjerter.
Abstract
Resident hjerte makrofager har vist seg å lette den elektriske ledningen i hjertet. Den fysiologiske hjerterytmen initieres av elektriske impulser generert i sinoatrialnoden (SAN) og ledes deretter til ventrikler via atrioventrikulær node (AVN). For å studere rollen som bosatt makrofager i hjerteledningssystemet, er det nødvendig med en skikkelig isolasjon av bosatte makrofager fra SAN og AVN, men det er fortsatt utfordrende. Her gir vi en protokoll for pålitelig mikrodisseksjon av SAN og AVN i murine hjerter etterfulgt av isolasjon og kultur av bosatt makrofager.
Både SAN som ligger i krysset mellom crista terminalis og den overlegne vena cava, og AVN som ligger på toppen av trekanten Koch, er identifisert og mikrodissekert. Korrekt plassering bekreftes ved histologisk analyse av vevet utført med Massons trikrome flekk og ved anti-HCN4.
Mikrodissected vev blir deretter enzymatisk fordøyd for å oppnå enkeltcellesuspensjoner etterfulgt av inkubasjon med et spesifikt panel av antistoffer rettet mot celle-type spesifikke overflatemarkører. Dette gjør det mulig å identifisere, telle eller isolere forskjellige cellepopulasjoner ved fluorescerende aktivert cellesortering. For å skille hjertebeboermakrofager fra andre immunceller i myokardiet, spesielt rekrutterte monocyttavledede makrofager, er det nødvendig med en delikat utviklet gatingstrategi. For det første oppdages lymfoide avstamningsceller og utelukkes fra videre analyse. Deretter identifiseres myeloide celler med bosatte makrofager som bestemmes ved høyt uttrykk av både CD45 og CD11b, og lavt uttrykk for Ly6C. Med cellesortering kan isolerte hjertemakrofager deretter dyrkes in vitro over flere dager for videre undersøkelse. Vi beskriver derfor en protokoll for å isolere hjertebeboermakrofager lokalisert i hjertets ledningssystem. Vi diskuterer fallgruver i mikrodissekering og fordøyelse av SAN og AVN, og gir en gating-strategi for pålitelig å identifisere, telle og sortere hjertemakrofager ved fluorescensaktivert cellesortering.
Introduction
Den sinoatriale knuten (SAN) initierer fysiologisk den elektriske impulsen og er derfor den primære pacemakeren i hjertet. Den atrioventrikulære knuten (AVN) utfører den elektriske impulsen fra atriene til ventriklene og fungerer også som en subsidiær pacemaker1. Generelt er generering og ledning av elektriske impulser en kompleks prosess som kan moduleres av ulike faktorer2, inkludert bosatt makrofag i SAN / AVN-regioner. En nylig studie av Hulsmans og medarbeidere demonstrerer en spesifikk populasjon av hjertebeboermakrofager som er beriket i AVN og fungerer som nøkkelspillere for å holde et jevnt hjerteslag3. De fant at makrofager er elektrisk koblet til kardiomyocytter og kan endre de elektriske egenskapene til koblede kardiomyocytter. Forfatterne bemerker også at slike ledende celler som går sammen med makrofager, også er tilstede i andre komponenter i hjerteledningssystemet, som SAN.
Foreløpig er det ikke fullt kjent om fenotypen av bosatte hjertemakrofager varierer mellom hjerteregionene. Det er imidlertid vist at vevsmikromiljøet kan påvirke transkripsjon og proliferativ fornyelse av vevsmakrofager4. Videre, siden kardiomyocyttfenotypen har vist seg å være forskjellig mellom regioner, kan de funksjonelle effektene av makrofager på kardiomyocytter også være regionspesifikke, selv om makrofagfenotypen i seg selv kan være den samme. Derfor er det behov for ytterligere studier på spesifikke hjerteregioner.
Nylige studier har vist at ved steady state etableres vevsbeboermakrofagene prenatalt, som oppstår uavhengig av definitiv hematopoiesis, og vedvarer inn i voksen alder5. Etter uttømming av makrofag eller under hjertebetennelse bidrar imidlertid Ly6c hi-monocytter til å fylle opp hjertemakrofagpopulasjonen6. Studier som involverte genetisk avstamningssporing, parabiose, skjebnekartlegging og cellesporing viste sameksistensen av en rekke populasjoner av vevsboende makrofager i organer og vev, og også forskjellig cellulær oppførsel av makrofagundergrupper som potensielt er forbundet med deres ontogeni 7,8,9.
Karakterisering av bosatte hjertemakrofager har hatt nytte av bruk av magnetisk aktivert cellesortering (MACS) og fluorescerende aktivert cellesortering. Disse metodene er spesielt nyttige for å isolere spesifikke cellepopulasjoner fra flere vevsfraksjoner ved å merke dem med deres celleoverflatemarkører. Dette fører ikke bare til en høyere renhet av den isolerte immuncelletypen, men tillater også fenotypisk analyse. Her presenterer vi en protokoll som inkluderer magnetiske perlebelagte celler etterfulgt av fluorescerende aktivert cellesortering for anrikning av hjerteboende makrofager spesielt isolert fra SAN- og AVN-regionen.
For å utforske egenskapene til hjertebeboermakrofager i ledningssystemet og deres funksjon for hjerteledning og arytmogenese, er presis lokalisering og disseksjon av SAN og AVN kritisk. For mikrodisseksjon av SAN og AVN brukes anatomiske landemerker for regionidentifikasjon10. Kort sagt, SAN ligger i krysset mellom den overlegne vena cava og høyre atrium. AVN ligger innenfor trekanten Koch, som er fremre avgrenset av septalbrosjyren til tricuspidventilen, og bakre av senen til Todaro11. Vi tilbyr også en nøyaktig mikrodisseksjonsprosedyre for SAN og AVN hos mus som bekreftes av histologi og immunfluorescensfarging.
Isolerte bosatt makrofager kan brukes til videre eksperimenter som RNA-sekvensering eller kan gjenopprettes og dyrkes i mer enn to uker slik at ulike in vitro-eksperimenter kan gjenopprettes. Derfor beskriver vår protokoll en svært verdifull prosedyre for immuno-rytologen. Tabell 1 viser sammensetningen av alle løsningene som trengs, figur 1 viser mikrodisseksjonslandemerkene for SAN og AVN. Figur 2 er skjematisk illustrasjon av SAN- og AVN-lokalisering. Figur 3 viser histologisk farging av SAN og AVN (Massons trikrom- og immunfluorescensfarging). Figur 4 viser en trinnvis gatingstrategi for å isolere hjertebeboermakrofager ved fluorescensaktivert cellesortering.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette manuskriptet beskriver vi en protokoll for anrikning av hjertebeboermakrofager spesifikt fra SAN- og AVN-regionene med høy renhet.
Makrofager er delt inn i underpopulasjoner basert på deres anatomiske plassering og funksjonelle fenotype. De kan også bytte fra en funksjonell fenotype til en annen som svar på variable mikromiljøsignaler13. Sammenlignet med andre organer som benmarg og lever, inneholder hjertevev en lavere prosentandel av immunceller og lavere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av China Scholarship Council (CSC, til R. Xia), det tyske senteret for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X2600255 til S. Clauss, 81Z0600206 til S. Kääb, 81Z0600204 til CS), Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. Clauss), SFB 914 (prosjekt Z01 til S. Massberg), ERA-NET om kardiovaskulære sykdommer (ERA-CVD; 01KL1910 til S. Clauss) og Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (til S. Clauss). Finansiørene hadde ingen rolle i utarbeidelsen av manuskriptet.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
