Centralnervesystemets metastase PDX-modeller repræsenterer de fænotypiske og molekylære egenskaber ved human metastase, hvilket gør dem til fremragende modeller til prækliniske undersøgelser. Her er beskrevet, hvordan man etablerer PDX-modeller og de podningsruter, der bedst anvendes til prækliniske undersøgelser.
Udviklingen af nye terapier til metastaser i centralnervesystemet (CNS) er blevet hæmmet af manglen på prækliniske modeller, der nøjagtigt repræsenterer sygdommen. Patientafledte xenograft (PDX) modeller af CNS-metastaser har vist sig bedre at repræsentere de fænotypiske og molekylære egenskaber ved den menneskelige sygdom samt bedre afspejle heterogeniteten og klondynamikken i humane patienttumorer sammenlignet med historiske cellelinjemodeller. Der er flere steder, der kan bruges til at implantere patientafledt væv, når der oprettes prækliniske forsøg, hver med deres egne fordele og ulemper, og hver egnet til at studere forskellige aspekter af den metastatiske kaskade. Her beskriver protokollen, hvordan man etablerer PDX-modeller og præsenterer tre forskellige tilgange til udnyttelse af CNS-metastase PDX-modeller i prækliniske studier, der diskuterer hver af deres anvendelser og begrænsninger. Disse omfatter flankeimplantation, ortopisk injektion i hjernen og intrakardial injektion. Subkutan flankeimplantation er den nemmeste at overvåge og derfor mest bekvem til prækliniske undersøgelser. Derudover blev metastaser til hjerne og andet væv fra flankeimplantation observeret, hvilket indikerer, at tumoren har gennemgået flere trin af metastase, herunder intravasation, ekstravasation og kolonisering. Ortopisk injektion i hjernen er den bedste mulighed for at rekapitulere hjernetumormikromiljøet og er nyttig til bestemmelse af effektiviteten af biologiske lægemidler til at krydse blod-hjernebarrieren (BBB), men omgår de fleste trin i den metastatiske kaskade. Intrakardial injektion letter metastase til hjernen og er også nyttig til at studere organtropisme. Mens denne metode giver afkald på tidligere trin i den metastatiske kaskade, skal disse celler stadig overleve cirkulation, ekstravasere og kolonisere. Nytten af en PDX-model påvirkes derfor af tumorinokulationsvejen, og valget af, hvilken der skal bruges, bør dikteres af det videnskabelige spørgsmål og eksperimentets overordnede mål.
Incidensen af metastaser til centralnervesystemet (CNS) er steget i de senere år 1,2,3. Traditionelle terapier til CNS-metastase, såsom tumorresektion, strålebehandling af hele hjernen og stereotaktisk strålekirurgi, har stort set været palliativ og sjældent helbredende og kan føre til svækkende bivirkninger, såsom kognitiv forringelse1. For nylig udvikles mange nye målrettede og immunologiske terapier til behandling af CNS-metastaser, der viser løfte om at være mere effektive behandlinger, samtidig med at de har færre bivirkninger4.
Oversættelse af prækliniske resultater til meningsfulde kliniske endepunkter kræver ofte effektive og prædiktive modelleringsstrategier. Historisk set var cellelinjexenograftmodeller standarden for præklinisk forskning i CNS-metastaseforskning. Disse cellelinjemodeller afspejler imidlertid ikke værtstumorens sande tumoradfærd eller repræsenterer sygdommens histologiske eller molekylære heterogenitet. Desuden er cellelinjemodeller i stand til at tilpasse sig in vitro vækstbetingelser og mister derfor værtstumorens oprindelige egenskaber. Patientafledte xenotransplantater (PDX’er), som indpoder en patients tumor i en immundefekt eller humaniseret mus, anvendes i stigende grad i translationel kræftforskning. Forskere har vist, at PDX-modeller normalt trofast kan rekapitulere tumorvækst, histologiske egenskaber, opretholde tumorheterogenitet, metastatisk potentiale og molekylære genetiske egenskaber. Derudover er PDX-modeller prognostiske, hvorved PDX-tumorlatensperioden korrelerer med patientens samlede overlevelse, og de har også vist sig nøjagtigt at forudsige terapeutisk respons i patientforsøg 5,6.
Der har været en fremkomst af CNS-metastase PDX’er. For det meste er disse blevet udviklet, der repræsenterer tumorer, der stammer fra en enkelt oprindelse, såsom ikke-småcellet lungekræft (NSCLC)7, brystkræft8,9 og melanom10,11. For nylig er der udviklet og karakteriseret en stor og forskelligartet samling PDX-modeller, der repræsenterer otte forskellige histologiske undertyper12. Det er blevet påvist, at PDX-modeller for CNS-metastaser ligner deres oprindelige patienttumor, både histologisk og molekylært og har også vist histologiske unikke forskelle og ligheder10,12. Desuden, mens de fleste CNS-metastaser PDX-modeller opretholder den klonale heterogenitet af humane tumorer, viste nogle tegn på klonal succession12, hvilket gør dem også ideelle til at studere resistens over for terapier ved at overvåge klonale ændringer efter behandling.
De her beskrevne protokoller skitserer metoder til etablering af PDX og forskellige podningsveje, der anvendes i prækliniske undersøgelser af CNS-metastaser (figur 1). Disse implantationsmetoder varierer i deres evne til at efterligne vækst og metastase. Her fremhæver protokollen applikationerne for hver implantationsvej og demonstrerer, hvordan de kan bruges til undersøgelse af CNS-metastaser.
I det nuværende manuskript er metoder til etablering og formering af PDX blevet detaljeret. Tre forskellige podningsmetoder, der kan bruges til at oprette prækliniske undersøgelser ved evaluering af CNS-metastase, er også blevet demonstreret. Den valgte metode bør afhænge af eksperimentets mål. I nogle tilfælde vil det være en fordel at anvende mere end én podningsvej. For eksempel giver subkutan flankeimplantation en enkel tilgang til at studere effektiviteten af et lægemiddel på tumorvækst og vurdere lægemidlet på dets mål, og det giver også en visuel for tumorstørrelse, der let overvåges og måles. Men når målet gennemførlighed og antitumor vækstegenskaber er etableret, kunne man oprette en ortopisk undersøgelse for at vurdere effektiviteten af det biologiske middel til at krydse BBB og studere dets virkning inden for hjernetumormikromiljøet. Overlevelse vurderes også bedre i ortopiske og intrakardiale injektionsstudier.
Intrakraniel injektion af hjernemetastase PDX-modeller er ofte den prækliniske model, der vælges på grund af tilstedeværelsen af hjernens mikromiljø og BBB. Undersøgelser har imidlertid vist, at hjernemetastaser har evnen til at ændre BBB, hvilket påvirker molekylernes permeabilitet til tumoren16. Disse ændringer i BBB ville ikke blive afspejlet af intrakranielt implanterede tumorer, og på grund af dette afspejler prækliniske lægemiddelundersøgelser muligvis ikke fuldt ud responsen fra patienttumorer. Selv med denne advarsel forbliver intrakraniel injektion den bedste metode til at teste permeabiliteten og effektiviteten af lægemidler til at krydse BBB i prækliniske modeller. En anden udfordring med intrakranielle modeller er, at de er vanskelige at overvåge tumorvækst og kræver brug af billeddannelsesteknikker. Viral transduktion af PDX’er med fluorescerende eller bioluminescerende markører har traditionelt været anvendt, men kan være udfordrende at udføre. Imidlertid udvikles flere billeddannelsesteknikker til brug hos mus, der ikke kræver introduktion af markører, hvilket kan forbedre den lette overvågning af disse ortopiske hjernetumorer til prækliniske undersøgelser. Disse omfatter billeddannelsesteknologier såsom magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) og positronemissionstomografi (PET) billeddannelse og mikrocomputertomografi (mikro-CT). Endelig kan intrakraniel injektion ikke nøjagtigt afspejle mikromiljøet af CNS-metastaser uden for hjernen, såsom i leptomeningeal metastase. I dette tilfælde kunne injektion i cisterna magna udføres for mere præcist at repræsentere leptomeningeale metastaser17.
Karakterisering af både de fænotypiske og molekylære egenskaber ved PDX-modellen er vigtig for at vælge de bedste modeller til prækliniske studier. Tumor latens kan variere fra 7-140 dage og tage satser kan også være meget variabel12. Det optimale antal dyr, der skal implanteres, og tidspunktet for påbegyndelse af behandlingen skal baseres på egenskaberne ved hver PDX-model og skal bestemmes empirisk. Desuden er PDX-tumorers molekylære profil også vigtig for udvælgelsen af de mest repræsentative PDX-modeller til prækliniske studier. Jo tættere modellen molekylært repræsenterer donorvævet, jo mere prædiktiv for klinisk respons vil det sandsynligvis være. Det er også afgørende at sikre, at de mål, der vælges ud fra humane data, er til stede i PDX’erne, der vælges til undersøgelser, og opretholdes gennem et par generationer, da påvist klonal succession er forbundet med en anden genomisk profil af den etablerede dominerende klon. I lyset af dette er de fænotypiske og molekylære profiler af CNS-metastasen PDX-tumorer blevet grundigt karakteriseret over flere generationer12.
På trods af de mange fordele ved at bruge CNS-metastase PDX-modeller er der flere begrænsninger relateret til deres anvendelse. For det første er et alternativt tumormikromiljø og især mangel på et immunsystem veldokumenterede begrænsninger ved PDX-modeller18. Xenograft af en human tumor i mus resulterer i udskiftning af human stroma med musestroma med hver efterfølgende passage, og den menneskelige stroma erstattes generelt fuldstændigt efter flere passager19. Forskellene i tumormikromiljøet resulterer imidlertid ikke i store forskelle i den molekylære profil af flankeimplanterede PDX-tumorer sammenlignet med den oprindelige patienttumor12, hvilket tyder på, at flankemodeller stadig repræsenterer gode eksperimentelle modeller til undersøgelse af CNS-metastase. For det andet resulterer brugen af immunkompromitterede dyr i mangel på immuncelleinfiltration i tumoren og et generelt immunrespons fra værten, hvilket begrænser en grundlæggende måde, hvorpå værten forsøger at bekæmpe kræftvækst12. Mens humaniserede mus indpodet med humane immunceller er tilgængelige for at studere interaktionerne mellem specifikke immunceller med tumoren, er der stadig mange spørgsmål og kontroverser om tilgange, metoder og fortolkning af disse resultater20.
Mens størstedelen af PDX’er har vist sig at være genetisk stabile, har vi og andre vist, at der i sjældne tilfælde, selv i mangel af behandlinger eller andet eksternt selektivt pres, kan være ændringer i tumorernes kloner, såsom mindre klonovertagelse12,14,15. Dette kunne resultere i dramatiske ændringer i den molekylære profil, hvilket i sidste ende ville gøre tumoren ikke afspejler de dominerende kloner i patientens tumor12. Mens PDX’er, der viser klonal succession, kan have brug i prækliniske undersøgelser, kan mange gener, der er beregnet til målretning (f.eks. Her2), gå tabt med klonal succession. Derfor opfordres der til hyppig screening af PDX-modeller for at afgøre, om de stadig opretholder den ønskede klons molekylære profil.
Sammenfattende repræsenterer PDX-modeller et fremragende modelsystem til undersøgelse af ikke kun CNS-metastase, men også andre tumortyper. Udviklingen af disse modeller har vist, at de stort set afspejler den fænotypic, molekylære profil og heterogenitet af human CNS-metastase 8,9,10,12. De tjener som effektive modeller til at studere både CNS-metastasebiologi og fungerer også godt som fysiologisk relevante prækliniske modeller, der erstatter overbrugte cellelinjemodeller, der historisk er brugt til in vivo-undersøgelser af CNS-metastase. Uden tvivl eksisterer forskelle mellem PDX og donorpatienttumor12,18. At vide, hvad disse forskelle er, er vigtigt for korrekt planlægning og udførelse af prækliniske undersøgelser. Endelig er PDX-modeller ved at vælge mellem flere podningsruter alsidige i deres anvendelse, hvilket gør det muligt at studere flere aspekter af sygdommen. PDX’er modeller vil uden tvivl spille en vigtig rolle i at fremme vores forståelse af CNS metastase og udviklingen af nye terapier.
The authors have nothing to disclose.
Figur 3A blev taget fra vores tidligere publikation12 og blev genereret i Dr. Jann Sarkarias laboratorium på Mayo Clinic.
25G needle | VWR | BD305122 | |
70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
Surgical glue | MedVet | VG3 | |
Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
Syringe | VWR | 53548-001 | |
Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |