Denne artikkelen demonstrerer utarbeidelsen av et skreddersydd bildevindu supplert med infusjonskanyle og implantasjon på CA1-regionen av hippocampus hos mus.
Imaging neuronal aktiviteter ved encellet oppløsning i våken oppføre dyr er en svært kraftig tilnærming for undersøkelse av nevrale kretsfunksjoner i systemer nevrovitenskap. Imidlertid begrenser høy absorbans og spredning av lys i pattedyrvev intravital avbildning for det meste til overfladiske hjerneregioner, og etterlater dype hjerneområder, som hippocampus, utenfor rekkevidde for optisk mikroskopi. I denne videoen viser vi forberedelsen og implantasjonen av det skreddersydde bildevinduet for å muliggjøre kronisk in vivo-avbildning av dorsal hippocampal CA1-regionen i hodefaste oppførende mus. Det skreddersydde vinduet er supplert med en infusjonskanyle som tillater målrettet levering av virale vektorer og legemidler til bildeområdet. Ved å kombinere dette preparatet med bredfeltsavbildning utførte vi en langsiktig registrering av nevronaktivitet ved hjelp av en fluorescerende kalsiumindikator fra store undergrupper av nevroner i å oppføre seg mus over flere uker. Vi demonstrerte også anvendbarheten av dette preparatet for spenningsavbildning med enkeltspissoppløsning. Høytytende genetisk kodede indikatorer på nevronaktivitet og vitenskapelige CMOS-kameraer tillot tilbakevendende visualisering av subcellulære morfologiske detaljer av enkle nevroner ved høy temporal oppløsning. Vi diskuterer også fordelene og potensielle begrensningene ved den beskrevne metoden og dens kompatibilitet med andre avbildningsteknikker.
Hippocampus er en viktig hjerneregion som er ansvarlig for læring og minne1, så vel som for romlignavigasjon 2. Hippocampal atrofi er forbundet med nevrologiske og psykiatriske lidelser som involverer hukommelsestap og kognitiv nedgang3,4,5. Hos mus er hippocampus en veldig veletablert modell for å studere romlig, kontekstuell og assosiativ læring og minnedannelse på celle- og nettverksnivå4,5. De mekanistiske studiene av læring og hukommelse krever langsgående forhør av nevronstruktur og funksjon i å oppføre seg mus. Fluorescensavbildning i kombinasjon med genetisk kodede sonder6 gir enestående evner til å registrere membranspenningsdynamikk7,8, kalsiumtransienter9, og strukturelle endringer10 over store undergrupper av nevroner intravitalt. Imidlertid er optisk tilgang til hippocampus hos mus blokkert av cortex, som kan nå over 1 mm i tykkelse. Her beskrev vi en prosedyre for montering av en skreddersydd bildebehandlingsenhet og dens kroniske implantasjon i musehodet for langsiktig optisk tilgang til CA1-underregionen av dorsal hippocampus i oppførende mus. Infusjonskanyle integrert i bildeimplantatet gjør det mulig å administrere virus eller legemidler direkte på nevronene innen synsfeltet. Det beskrevne preparatet i kombinasjon med bredfeltsmikroskopi muliggjør tilbakevendende avbildning av de store undergruppene av nevroner i å oppføre seg mus over lange perioder. Vi brukte dette preparatet til å uttrykke kalsium- og spenningsgenetisk kodede indikatorer i hippocampal CA1-regionen via målrettet injeksjon av rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) for nevronale aktivitetsopptak ved encellet oppløsning. Vi utførte også langsgående kalsiumavbildning av de tilsvarende nevronale undergruppene ved høy romlig oppløsning ved å oppføre seg dyr. I tillegg er dette preparatet kompatibelt med multifotonmikroskopi og mikroendoskopi, og utvider dermed verktøykassen for avbildningsteknikker ytterligere for å studere nevronnettverk på cellulære og subcellulære nivåer i å oppføre seg mus. Vi beskrev kritiske trinn og feilsøking av protokollen. Vi diskuterte også mulige fallgruver og begrensninger ved metoden.
Her beskriver vi en metode for langsiktig bildebehandling av hippocampus CA1-regionen i oppførende mus. Metoden er basert på kronisk implantasjon av et skreddersydd bildevindu, som også muliggjør målrettet administrering av virus eller legemidler direkte til nevronene av interesse. Den nåværende protokollen består av fire hoveddeler: i) montering av bildeimplantat; ii) installasjon av bildeimplantat; iii) virusinjeksjon via bildeimplantat; iv) funksjonell avbildning i å oppføre seg mus. Nedenfor beskriver og diskuterer vi kritiske trinn i protokollen, feilsøking, modifikasjoner og begrensninger av metoden. Vi diskuterer også betydningen av metoden og dens potensielle alternative anvendelser.
Det er flere kritiske trinn i den beskrevne protokollen som er ganske viktige for vellykket kirurgi: (i) forberedelse av et bildeimplantat av høy kvalitet; (ii) sterile kirurgiske forhold; (iii) aspirasjon av cortex; (iv) presis plassering av bildeimplantatet; (v) viral injeksjon. Som trinn 1.6 indikerer, vil overflødig loddeform kreve en større kraniotomi og dermed øke risikoen for betennelse. Det er også svært viktig å bruke en passende mengde lim optisk lim når du fester dekkglasset til bildekanylen, som angitt i trinn 1.11, da en utilstrekkelig mengde kan føre til lekkasje av cerebrospinalvæske i bildekanylen og gjøre den ugjennomsiktig. På den annen side kan overflødig optisk lim føre til redusert gjennomsiktighet av glassvinduet. Mulig kontaminering av bildeimplantatet kan føre til en aktiv spredning av bindevev under det optiske vinduet og/eller alvorlig betennelse, noe som vil føre til tidlig avslutning av eksperimentet. Derfor er avbildningsimplantatmontering og forberedelse før operasjonen nesten like viktig som selve kirurgiske prosedyren.
Under operasjonen er den delen av cortex under kraniotomi ablated av mild aspirasjon, noe som resulterer i uunngåelig blødning. Blod på operasjonsstedet reduserer synligheten av hjernevevet som må fjernes betydelig. Dette kompliserer den nøyaktige vurderingen av den nødvendige dybden av vevsablasjon. Forsiktig skylling av operasjonsstedet med PBS hver gang før påføring av sug for å fjerne neste del av vevet gir bedre kontroll over dybden. Hjernevevet bør alltid fjernes i små porsjoner trinn for trinn som bekrefter dybden av ablated vev før du fortsetter med mer sug. Finere kontroll av sug kan også oppnås med en tynnere stump nål. Vi foreslår at du bruker en 26 G nål, men mindre enn 26 G diameter er mer utsatt for tilstopping. Videre tar det vanligvis mye øvelse å bestemme den nøyaktige aspirasjonsdybden som kreves for hvert dyr, da fargen på cortex, corpus callosum og hippocampus kan variere fra mus til mus (figur 3).
Innsetting og sikring av bildeimplantatet bør gjøres veldig presist for å sikre nærmeste mulige posisjon av bildevinduet til dorsale overflate. Størrelsen på den tilberedte kraniotomien bør samsvare nøye med implantatet og tillate innsetting uten betydelig motstand. Samtidig bør det ikke være noe synlig gap mellom skallen og implantatet for å sikre riktig forsegling og unngå eksponering av hjernevev. Forsiktig og stabilt trykk skal påføres toppen av implantatet under forseglingen til skallen. Det er nesten uunngåelig å ha blod under bildevinduet under implantatinstallasjonen. Hvis den kirurgiske prosedyren er gjort riktig, bør vinduet rydde ut om 3-7 dager, og hjernevaskulaturen blir tydelig synlig. Det er også viktig å sikre at virus injiseres riktig under vinduet. Ved mislykket uttrykk kan virus injiseres på nytt flere ganger.
Den store komplikasjonen vi opplevde i noen tilfeller er redusert synlighet av bildevinduet. Det er flere mulige årsaker til dårlig bildekvalitet: i) pågående betennelse; ii) utvekst av bindevev på glasset; iii) stort gap mellom vinduet og hippocampus. Betennelse er vanligvis forårsaket av forurensning under operasjonen eller ved ikke riktig sterilisert bildeimplantat. Vi foreslår autoklavering av kirurgiske instrumenter før og etter hver operasjon, desinfiserer operasjonsområdet rett før prosedyren, og bruker rent personlig verneutstyr under operasjonen. Bildeimplantater bør rengjøres etter montering, sterilisert og oppbevares under sterile forhold. Utveksten av bindevev på glasset av bildeimplantat kan skyldes mekanisk forurensning på overflaten av glasset eller overdreven traumer i hjernevevet under cortex ablasjon. Etter montering av implantatet er det viktig å bekrefte at glassoverflaten er ren og glatt. Også alle biter av skadet hjernevev må fjernes forsiktig før du setter inn bildeimplantat i kraniotomien. I visse tilfeller resulterer gapet mellom glassvinduet og hippocampus i opphopning av cerebrospinalvæske, noe som reduserer kvaliteten på avbildningen. Derfor, under implantatinstallasjon, er det viktig å sette det helt inn for å sikre god kontakt mellom hippocampus og glassvindu. Noen ganger er det vanskelig å identifisere den eksakte årsaken til ugjennomsiktig bildevindu. Vi foreslår at du utfører post-mortem analyse for å avsløre forholdene under det optiske vinduet og tilsvarende justere påfølgende operasjoner.
Metoden har flere grunnleggende og tekniske begrensninger som bør tas i betraktning før og under in vivo-avbildning. En av de viktigste begrensningene er cortex ablasjon. En del av den visuelle og sensoriske cortex fjernes under operasjonen. Selv om det er vanskelig å nøyaktig evaluere virkningen av cortex ablasjon, som fjernet hjernevev ikke direkte projiserer på hippocampus, flere studier viste ingen merkbar svekkelse av hippocampal-avhengig læring eller andre relevante hippocampus funksjoner15,16. De optiske begrensningene bør også vurderes, spesielt når høye NA objektive linser brukes. For eksempel brukte vi i denne studien en 1,75 mm lang kanyle med en 1,9 mm indre diameter. Geometrien i denne kanylen vil ikke bevare hele NA av luftmålet med NA mer enn ~ 0,5 eller vannmål med NA mer enn ~ 0,6 som det vil klippe noe av lys. En annen begrensning, vanlig for alle hjerneavbildningsimplantater, er at en del av hjernen blir utsatt, og dermed fremmer varmetap17,18. Imidlertid kan fysiologisk hjernetemperatur lett gjenopprettes under avbildning ved perfusjon av en varm buffer.
Den beskrevne metoden kan enkelt endres eller justeres for andre applikasjoner. For eksempel kan preparatet tilpasses for avbildning av striatum7. Ettersom striatum ligger litt dypere enn hippocampus, bør den lengre bildekanylen brukes til montering av bildeimplantat. Vi foreslår at du bruker 2,0 mm bildekanyle. Koordinatene til kraniotomien bør justeres tilsvarende (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). I tillegg gjør virusinjeksjon via infusjonskanyle det mulig å oppnå uttrykket av en transgene i et tynt lag av nevroner når du bruker AAV-serotype med begrenset spredning19,20. Det er spesielt gunstig for en-foton bildebehandling på grunn av redusert out-of-focus fluorescens fra dypere lag og som et resultat forbedret encellet oppløsning bildebehandling. Videre kan injeksjonskanyle også brukes under funksjonell avbildning for administrering av legemidler eller andre kjemikalier direkte på nevronene i FOV (Figur 5B). Generell infusjonskanyle tilfører nyttige funksjoner til bildeimplantatet, forbedrer bildekvaliteten på grunn av det målrettede virale uttrykket og muliggjør farmakologisk stimulering av nevroner i FOV. Den brukte hodeplaten gir ekstraordinær stabilitet av bildeimplantat som minimerer bevegelsesartefakter selv i aktivt bevegelige dyr på en tredemølle. Hodeplaten er liten og lett, forårsaker minimal ubehag for dyr, og forblir stabil i flere måneder etter installasjon. Bildeimplantatet er også kompatibelt med multifotonavbildning15,16,21 og kan kombineres med mikro-endoskop22,23. Et lignende bildeimplantat ble også brukt til flerfotonavbildning av de dypere hippocampusstrukturene, inkludert stratum radiatum, stratum laktunose og dentate gyrus16,24,25,26,27. Imidlertid kan målretting av de dypere hippocampusstrukturene med AAVs via infusjonskanyle kreve ytterligere optimalisering av AAV-serotypen og volum19.
Vi tror at den beskrevne protokollen vil lette studier som tar sikte på å undersøke nevronal aktivitet med høy romlig oppløsning i hippocampus av oppføre seg mus ved hjelp av enkle og rimelige one-photon bildeoppsett.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke alle medlemmene av Molecular BioEngineering Group ved Westlake University for all hjelp og nyttig diskusjon. Vi takker også Jinze Li og Jie-Min Jia fra Westlake University for hjelpen med å filme den kirurgiske prosedyren.
Dette arbeidet ble støttet av oppstartsfinansiering fra Foundation of Westlake University, 2020 BBRF Young Investigator Grant, og National Natural Science Foundation of China grant 32050410298 alle til K.D.P.
Cover glass | Deckgläser | 72296-03 | |
denture base resin | ShangHai New Centery Dentel Material | N/A | Type I, self-solidifying |
Dummy Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62102 | OD 0.30mm |
Guide Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62003 | 26G |
Head Fork | N/A | N/A | Custom made |
Head Plate | N/A | N/A | Custom made |
Imaging Cannula | N/A | N/A | Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel |
Internal Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62203 | 0.30*0.14 (OD*ID, mm) |
Kwik Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
SuperBond C&B | SUN MEDICAL | N/A | SuperBond C&B kit |
Treadmill Kit | N/A | N/A | Custom made |
UV-cured Adhesive | NORLAND PRODUCTS | NOA 60 |