यह प्रोटोकॉल कार्यात्मक अल्ट्रासाउंड (एफएसयू) का उपयोग करके माउस मस्तिष्क में वॉल्यूमेर सेरेब्रल हीमोडायनामिक विविधताओं के मात्राकरण का वर्णन करता है। संवेदी उत्तेजना के साथ-साथ आराम-राज्य कार्यात्मक कनेक्टिविटी के बाद 3 डी कार्यात्मक सक्रियण मानचित्र के लिए प्रक्रियाएं उदाहरण के रूप में प्रदान की जाती हैं, एनेस्थेटाइज्ड और जागते चूहों में।
कार्यात्मक अल्ट्रासाउंड (एफएस) इमेजिंग एक उपन्यास ब्रेन इमेजिंग मोडलिटी है जो अल्ट्राफास्ट डॉप्लर एंजियोग्राफी द्वारा प्राप्त मस्तिष्क रक्त की मात्रा के उच्च संवेदनशीलता उपाय पर निर्भर करता है। चूंकि मस्तिष्क परफ्यूजन स्थानीय न्यूरोनल गतिविधि से दृढ़ता से जुड़ा हुआ है, इस तकनीक से पूरे मस्तिष्क को कार्य-प्रेरित क्षेत्रीय सक्रियण के साथ-साथ आराम-राज्य कार्यात्मक कनेक्टिविटी, गैर-आक्रामक, बेजोड़ स्पेटियो-टेम्पोरल संकल्प और परिचालन सादगी के साथ पूरे मस्तिष्क 3 डी मैपिंग की अनुमति मिलती है। एफएमआरआई (कार्यात्मक चुंबकीय अनुनय इमेजिंग) की तुलना में, एफएसयू इमेजिंग का मुख्य लाभ जागने और व्यवहार करने वाले पशु प्रयोगों के साथ पूर्ण अनुकूलता को सक्षम करने में होता है। इसके अलावा, चूहों में एफएमआरआई ब्रेन मैपिंग, न्यूरोसाइंस में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले प्रीक्लिनिकल मॉडल, मस्तिष्क के छोटे आकार और स्थिर शारीरिक स्थितियों को बनाए रखने में कठिनाई के कारण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण रहता है। यहां हम एक मोटराइज्ड रैखिक ट्रांसड्यूसर के साथ ऑफ-द-शेल्फ वाणिज्यिक एफयूएस सिस्टम का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड और जागने वाले चूहों में पूरे मस्तिष्क एफयूएस इमेजिंग के लिए एक सरल, विश्वसनीय और मजबूत प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जिससे संवेदी उत्तेजना के साथ-साथ नेटवर्क पहचान के लिए प्रजनन योग्य 3 डी कार्यात्मक कनेक्टिविटी पैटर्न के बाद महत्वपूर्ण कॉर्टिकल एक्टिवेशन होता है।
पिछले दो दशकों में, न्यूरोइमेजिंग मस्तिष्क समारोह और संगठन का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है, शोधकर्ताओं को तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में महत्वपूर्ण खोजों को सक्षम करने के लिए । आज, कार्यात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एफएमआरआई) कार्य या दवा-पैदा किए गए मस्तिष्क सक्रियण का आकलन करने और आराम से कार्यात्मक कनेक्टिविटी को मैप करने के लिए स्वर्ण मानक नैदानिक न्यूरोइमेजिंग तकनीक बन गई है। जबकि मानव एफएमआरआई में उच्च विश्वसनीयता और संवेदनशीलता है, माउस एफएमआरआई कई कारणों से तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है1। सबसे पहले, एफएमआरआई में एक खराब स्थानिक और लौकिक संकल्प है। माउस मस्तिष्क के छोटे आकार के लिए उचित स्थानिक संकल्प प्राप्त करने के लिए महंगे स्कैनर का उपयोग कर मजबूत चुंबकीय क्षेत्रों के उपयोग की आवश्यकता होती है। दूसरा, कुशल न्यूरो-वैस्कुलर कपलिंग की अनुमति देने वाली संकीर्ण सीमा के भीतर स्थिर शारीरिक मापदंडों को बनाए रखना एनेस्थेटाइज्ड चूहों में बहुत मुश्किल है। अंत में, रक्त ऑक्सीजन स्तर निर्भर (बोल्ड) संकेत जिस पर एफएमआरआई अध्ययन भरोसा अपेक्षाकृत खराब संवेदनशीलता है, चूहों पर लागू होने पर कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है और अक्सर छोटे बदलावों का पता लगाने के लिए लंबे अधिग्रहण पर बार-बार उत्तेजना प्रस्तुति की आवश्यकता होती है। माउस जैव चिकित्सा पूर्व नैदानिक अनुसंधान में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला पशु मॉडल है, ये सीमाएं न्यूरोसाइकियाट्री में ट्रांसलेशनल गैप के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार हैं, बेंच पर नए आशाजनक चिकित्सीय लक्ष्यों को बिस्तर पर प्रभावी उपचार में स्थानांतरित करने में बाधा डालती हैं।
कार्यात्मक अल्ट्रासाउंड (एफयूएस) अल्ट्राफास्ट डॉप्लर2के आधार पर हाल ही में विकसित न्यूरोइमेजिंग तकनीक है। सीधे सेरेब्रल रक्त की मात्रा का नमूना लेकर, यह तकनीक न्यूरोवैस्कुलर कपलिंग के माध्यम से वास्तविक समय में मस्तिष्क गतिविधि की जांच करने की अनुमति देती है। अन्य न्यूरोइमेजिंग तकनीकों की तुलना में, एफयूएस 100 माइक्रोन का स्थानिक समाधान और मिलीसेकंड के दसियों में एक अस्थायी संकल्प पैदा करता है। यह तकनीक माउस मस्तिष्क के पूर्ण कोरोनल वर्गों की पूरी मस्तिष्क इमेजिंग की अनुमति देती है, पूरी तरह से गैर-आक्रामक रूप से। इसके अलावा, यह पूरी तरह से जागरूक और व्यवहार जानवरों के साथ संगत है3,4,5। एफयूएस की मुख्य वर्तमान सीमाओं में से एक इसकी 2डी सुविधा है, जो एक ही समय में एक कोरोनल विमान रिकॉर्ड करने की अनुमति देती है। जबकि वॉल्यूमेट्रिक 3डी एफएसयू 2डी मैट्रिक्स सरणी ट्रांसड्यूसर का उपयोग करके पहले ही चूहों6 में सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया है और चूहों7में पुष्टि की गई है, इसकी संवेदनशीलता की वर्तमान कमी के साथ-साथ गतिविधि के मामूली परिवर्तन का पता लगाने के लिए परीक्षणों की एक महत्वपूर्ण संख्या का औसत होना आवश्यक है। वैकल्पिक रूप से, रैखिक ट्रांसड्यूसर को कई पदों पर ले जाया जा सकता है और पूरे मस्तिष्क को कवर करने के लिए विमान द्वारा कार्यात्मक इमेजिंग विमान का प्रदर्शन किया जा सकता है। हालांकि, इस तकनीक के लिए कई प्रयोगात्मक प्रतिमान पुनरावृत्ति की आवश्यकता होती है और इस तरह के लंबे अधिग्रहण समय (माउस मस्तिष्क के लिए 3-4 घंटे)8,9।
वर्तमान कार्य में, हम एक मजबूत प्रयोगात्मक मंच का वर्णन करते हैं जिसमें एक वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध कार्यात्मक अल्ट्रासाउंड स्कैनर और एनेस्थेटाइज्ड और जागने वाले चूहों में 3D एफएसयू डेटा प्राप्त करने की प्रक्रियाओं के साथ एक तेज विमान-स्विचिंग रैखिक ट्रांसड्यूसर शामिल है, जो माउस मस्तिष्क के वॉल्यूमेट्रिक और ट्रांसक्रैनियल कार्यात्मक मानचित्रण की अनुमति देता है, गैर-आक्रामक, विपरीत एजेंट के बिना और कम अधिग्रहण समय के भीतर। हम मूंछ उत्तेजना के साथ-साथ आराम-राज्य कार्यात्मक कनेक्टिविटी के बाद सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स एक्टिवेशन का मानचित्रण करके इस सुविधा को चित्रित करते हैं। पशु तैयारी और डेटा संग्रह के अलावा, हम वास्तविक समय के एफयूएस संकेतों के दृश्य, एटलस पंजीकरण और विश्लेषण की प्रक्रिया का भी वर्णन करते हैं।
पूरे मस्तिष्क इमेजिंग तरीकों बेहतर मस्तिष्क शरीर विज्ञान और विकृति को समझने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। यहां वर्णित विधि सीधे बेंच पर जीवित मस्तिष्क में हीमोडायनामिक संकेतों के सटीक मात्राकरण की अनुमति देती है। कार्यात्मक अल्ट्रासाउंड की बेजोड़ संवेदनशीलता और स्थानिक-लौकिक संकल्प विशेष रूप से माउस फिजियोलॉजी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं और आराम-राज्य नेटवर्क को एक विश्वसनीय उपाय प्राप्त करने के लिए औसत परीक्षणों या विषयों के बिना, कम अधिग्रहण समय के भीतर मैप किया जा सकता है। उच्च संवेदनशीलता अल्ट्रासोनिक रैखिक जांच और तेजी से मोटरचालित सेटअप का प्रासंगिक संयोजन एक उचित अधिग्रहण समय के भीतर चूहों में ट्रांसक्रैनियल वॉल्यूमेट्रिक फ्यूस इमेजिंग करने में सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल मोबाइल होम पिंजरे का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड या जागने वाले चूहों पर या तो किया जा सकता है।
मूंछ उत्तेजना, संवेदी उत्तेजना इस पांडुलिपि में एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया, कृंतक में एक मानक कार्यात्मक सक्रियण प्रतिमान और संवेदी प्रसंस्करण, न्यूरोवैस्कुलर युग्मन और उनके परिवर्तन5,6,10, 11का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय पढ़ा बाहर है । जबकि मूंछ के मोटे मैनुअल ब्रश को इसके उपयोग में आसानी के लिए पसंद किया जा सकता है, इस विधि में स्थानिक और लौकिक परिशुद्धता का अभाव है। एक स्वचालित उत्तेजक का उपयोग, जैसे कि यहां वर्णित एफयूएस इमेजिंग स्कैनर के साथ ट्रिगर किया गया है, शुरुआत के समय, आयाम विस्थापन, आवृत्ति के साथ-साथ क्यू-टिप/कंघी के कोण सहित कई मापदंडों के बेहतर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप एक बेहतर अंतर-पशु प्रजनन क्षमता होती है। इसके अतिरिक्त, उत्तेजना का एक अधिक सटीक समय12,13को पीक मापदंडों के लिए शुरुआत और समय निर्धारित करके हीमोडायनामिक रिस्पांस फंक्शन (एचआरएफ) के मॉडलिंग को सक्षम बनाता है। उत्तेजना (और इस प्रकार सक्रिय क्षेत्र के क्षेत्र) के दौरान विक्षेपित मूंछ की संख्या पर बेहतर सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, अधिक परिष्कृत उत्तेजक इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रकाश8,ध्वनि14 या गंध प्रस्तुति15 जैसे कई अन्य उत्तेजनाओं को एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करके लागू किया जा सकता है।
जागने और व्यवहार करने वाले जानवरों के साथ कार्यात्मक अल्ट्रासाउंड की अनुकूलता अन्य न्यूरोइमेजिंग तकनीकों की तुलना में एक महत्वपूर्ण लाभ है, जो संज्ञाहरण पूर्वाग्रह के बिना कार्यात्मक सक्रियण मानचित्रण को सक्षम करता है। एक हवा से उठा मोबाइल होमकेज का उपयोग करना अन्य मौजूदा हेड-फिक्स्ड उपकरण जैसे रैखिक या गोलाकार ट्रेडमिल्स के लिए एक अच्छा विकल्प है। जबकि दृढ़ता से सिर तय किया जा रहा है, होमकेज की गति माउस को पर्यावरण को नेविगेट करने का भ्रम देती है, जिससे व्यवहार परीक्षणों की एक विस्तृत श्रृंखला को एफयूएस इमेजिंग16के साथ जोड़ा जा सकता है। हालांकि, सिर फिक्सिंग के लिए आदत प्रक्रिया तनाव को कम करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, विशेष रूप से प्रयोगों के लिए जहां यह एक भ्रामक कारक माना जा सकता है । यहां विस्तृत प्रक्रिया (हैंडलिंग और सिर निर्धारण के लिए आदत के 6 दिन) संवेदी उत्तेजना और आराम-राज्य कार्यात्मक कनेक्टिविटी के लिए मजबूत परिणाम देता है । हालांकि , अधिक परिष्कृत व्यवहार परीक्षणों के लिए आदत अवधि का विस्तार करना आवश्यक हो सकता है17.
The authors have nothing to disclose.
इस काम को यूरोपियन रिसर्च काउंसिल (ईआरसी) एडवांस्ड ग्रांट एन ° 339244-FUSIMAGINE द्वारा समर्थित किया गया था, नेशनल एजेंसी फॉर रिसर्च फंडिंग ‘पिंच’ (एएनआर-18-सीई 37-005), बायोमेडिकल अल्ट्रासाउंड में इन्सेर्म रिसर्च टेक्नोलॉजी एक्सीलरेटर, आईपीएनपी के एल्फ़स टेक्निकल कोर, इन्सेर्म यू1266, ह्यूमन ब्रेन प्रोजेक्ट के यूरोपियन रिसर्च प्रोग्राम FUSIMICE, और ईएमबीओ शॉर्ट-टर्म फेलोशिप 8439 एंड्रिया क्लीवर को।
BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
Depilatory cream | Klorane | N/A | |
Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
Servomotor | Feetech | FT90B | |
Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |