Detta protokoll beskriver kvantifieringen av volymetrisk cerebral hemodynamic variationer i mushjärnan med hjälp av funktionella ultraljud (fUS). Procedurer för 3D funktionell aktiveringskarta efter sensorisk stimulering samt vilotillstånd funktionell anslutning tillhandahålls som illustrativa exempel, i sövda och vakna möss.
Funktionell ultraljud (fUS) imaging är en ny hjärnan imaging modalitet som förlitar sig på hög känslighet måttet på cerebrala blod volym uppnås av ultrasnabb doppler angiografi. Eftersom hjärnan perfusion är starkt kopplad till lokala neuronal aktivitet, tillåter denna teknik hela hjärnan 3D mappning av uppgift-inducerad regional aktivering samt vilo-tillstånd funktionella anslutning, icke-invasivt, med oöverträffad spatio-temporal upplösning och operativ enkelhet. I jämförelse med fMRI (functional magnetic resonance imaging) består en stor fördel med fUS-avbildning i att möjliggöra en fullständig kompatibilitet med vakna och betedande djurförsök. Dessutom är fMRI-hjärnkartläggning hos möss, den mest använda prekliniska modellen i neurovetenskap, fortfarande tekniskt utmanande på grund av hjärnans lilla storlek och svårigheten att upprätthålla stabila fysiologiska förhållanden. Här presenterar vi ett enkelt, pålitligt och robust protokoll för helhjärna fUS imaging i sövda och vakna möss med hjälp av ett off-the-shelf kommersiell fUS-system med en motoriserad linjär givare, vilket ger betydande när aktivering efter sensorisk stimulering samt reproducerbara 3D funktionella anslutningsmönster för nätverksidentifiering.
Under de senaste två decennierna har neuroimaging blivit ett viktigt verktyg för att studera hjärnans funktion och organisation, vilket gör det möjligt för forskare att göra viktiga upptäckter inom neurovetenskap. Idag har funktionell magnetisk resonanstomografi (fMRI) blivit den kliniska neuroimaging-tekniken för guldstandard för att bedöma uppgift eller läkemedelsförand hjärnaktivering och kartlägga funktionell anslutning i vila. Medan mänsklig fMRI har hög tillförlitlighet och känslighet, är mus fMRI fortfarande tekniskt utmanande av många skäl1. För det första har fMRI en dålig rumslig och tidsmässig upplösning. Den lilla storleken på mushjärnan kräver användning av starka magnetfält med dyra skannrar för att uppnå rimlig rumslig upplösning. För det andra är det mycket svårt att upprätthålla stabila fysiologiska parametrar inom det smala intervallet som möjliggör effektiv neuro-vaskulär koppling hos sövda möss. Slutligen har den blodsyrenivåberoende (BOLD) signal som fMRI-studier förlitar sig på relativt dålig känslighet, vilket leder till lågt signal-till-brus-förhållande när det appliceras på möss och kräver ofta upprepad stimulanspresentation över långt förvärv för att upptäcka små variationer. Musen är den mest använda djurmodellen i biomedicinsk preklinisk forskning, dessa begränsningar är delvis ansvariga för translationella gapet i neuropsykiatri, vilket hindrar nya lovande terapeutiska mål på bänken som ska införlivas i effektiva behandlingar på sängen.
Funktionell ultraljud (fUS) är en nyligen utvecklad neuroimaging teknik baserad på ultrasnabb doppler2. Genom att direkt provtagning cerebral blod volym, denna teknik tillåter sondering hjärnaktivitet i realtid genom neurovaskulära kopplingen. Jämfört med andra neuroimaging tekniker ger fUS en rumslig upplösning på 100 μm och en temporal upplösning i tiotals millisekunder. Denna teknik tillåter hel-hjärnan imaging av kompletta koronal delar av mushjärnan, helt icke-invasivt. Dessutom är den fullt kompatibel med medvetna och betedande djur3,4,5. En av de viktigaste nuvarande begränsningarna för fUS är dess 2D-funktion, vilket gör det möjligt att spela in ett enda koronalplan samtidigt. Medan volymetrisk 3D fUS med hjälp av 2D matrismatrisgivare redan har visats framgångsrikt hos råttor6 och bekräftats hos möss7, kräver dess nuvarande brist på känslighet en fullständig kraniotomi samt i genomsnitt ett viktigt antal prövningar för att upptäcka en liten förändring av aktiviteten. Alternativt kan linjära givare klivas över flera positioner och utföra funktionella bildplan med plan för att täcka hela hjärnan. Denna teknik kräver dock många experimentella paradigmrepetitioner och som sådan långa förvärvstider (3-4 timmar för mushjärnan)8,9.
I det nuvarande arbetet beskriver vi en robust experimentell plattform inklusive en kommersiellt tillgänglig funktionell ultraljudsskanner och en snabb planväxling linjär givare med förfaranden för att förvärva 3D fUS-data i sövda och vakna möss, vilket möjliggör volymetrisk och transkraniell funktionell kartläggning av mushjärnan, icke-invasivt, utan kontrastmedel och inom korta förvärvstider. Vi illustrerar denna funktion genom att mappa somatosensory cortex aktivering efter whisker stimulering samt vilotillstånd funktionella anslutning. Förutom djurberedning och datainsamling beskriver vi också förfarandet för visualisering, atlasregistrering och analys av fUS-signaler i realtid.
Hela hjärnan imaging metoder är avgörande verktyg för att bättre förstå hjärnans fysiologi och patologi. Metoden som beskrivs här möjliggör exakt kvantifiering av hemodynamiska signaler i den levande hjärnan direkt vid bänken. Oöverträffad känslighet och spatio-temporal upplösning av funktionella ultraljud är särskilt väl lämpad för musen fysiologi. Funktionella svar och vilotillståndsnätverk kan kartläggas inom korta förvärvstider, longitudinellt och utan att behöva göra genomsnittliga försök eller försökspersoner för att få en tillförlitlig åtgärd. Den relevanta kombinationen av hög känslighet ultraljud linjära sonder och snabba motoriserade inställningar gör det möjligt att utföra transkraniell volumetric fUS imaging i möss inom rimliga förvärvstider. Detta protokoll kan utföras antingen på sövda eller vakna möss med hjälp av en mobil hembur.
Whisker stimulering, den sensoriska stimulansen som används som ett illustrerande exempel i detta manuskript, är ett standard funktionellt aktiveringsparadigm hos gnagare och en pålitlig avläsning för att studera sensorisk bearbetning, neurovaskulära kopplingar och deras förändringar5,6,10,11. Medan grov manuell borstning av whiskers kan föredras för dess användarvänlighet, saknar denna metod rumslig och temporal precision. Användningen av en automatisk stimulator, såsom den som beskrivs här utlöstes med fUS-bildskannern, möjliggör en bättre kontroll av flera parametrar inklusive tidpunkten för insjuknandet, amplitudförskjutningen, frekvensen samt vinkeln på Q-spetsen / kammen, vilket resulterar i en bättre reproducerbarhet mellan djur. Dessutom möjliggör en mer exakt tidpunkt för stimulering modellering av hemodynamisk responsfunktion (HRF) genom att bestämma tiden till debut och tid tilltoppparametrarna 12,13. För att säkerställa bättre precision på antalet whiskers som avböjs under stimuleringen (och därmed området i den aktiverade regionen) kan mer sofistikerade stimulatorer anpassas till detta protokoll. Många andra stimuli som ljus8, ljud14 eller luktpresentation15 kan implementeras med samma protokoll.
Kompatibiliteten hos funktionell ultraljud med vakna och betedande djur är en viktig fördel jämfört med andra neuroimaging tekniker, vilket möjliggör funktionell aktivering mappning utan anestesi bias. Att använda en luftlyft mobil hemifrån är ett bra alternativ till andra befintliga huvud-fasta apparater som linjära eller sfäriska löpband. Samtidigt som den är fast huvud-fixerad, ger homecage rörelse musen illusionen att navigera i miljön, så att ett brett utbud av beteendetester kan kopplas till fUS imaging16. Tillvänjningsförfarandet för huvudfixering utgör dock ett viktigt steg för att minska stress, särskilt för experiment där det kan betraktas som en förvirrande faktor. Förfarandet som beskrivs här (6-dagars hantering och tillvänjning till huvudfixering) ger robusta resultat för sensorisk stimulering och vilotillstånd funktionell anslutning. Det kan dock vara nödvändigt att förlänga tillvänjningsperioden för mer raffinerade beteendetester17.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet (ERC) Advanced Grant N° 339244-FUSIMAGINE, National Agency for Research funding ‘Pinch’ (ANR-18-CE37-005), Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasonic, ElfUS tekniska kärna av IPNP, Inserm U1266, det europeiska forskningsprogrammet FUSIMICE of the Human Brain Project och EMBO Short-Term Fellowship 8439.
BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
Depilatory cream | Klorane | N/A | |
Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
Servomotor | Feetech | FT90B | |
Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |