Protokollet som presenteras här beskriver användningen av Spotiton, ett nytt robotsystem, för att leverera två prover av intresse till ett självtransporterande nanotrådsnät som blandas i minst 90 ms före vitrifiering i flytande kryogen.
Fångsten av kortlivade molekylära tillstånd som utlöses av det tidiga mötet mellan två eller flera interagerande partiklar fortsätter att vara en experimentell utmaning av stort intresse för kryoelektronmikroskopi (cryo-EM). Några metodologiska strategier har utvecklats som stöder dessa “tidsuppfriade” studier, varav en, Spotiton-ett nytt robotsystem- kombinerar dispensering av picoliterstora provdroppar med exakt temporal och rumslig kontroll. Det tidsupplösta Spotiton-arbetsflödet erbjuder ett unikt effektivt tillvägagångssätt för att förhöra tidiga strukturella omorganiseringar från minimal provvolym. Avfyras från oberoende kontrollerade piezoelektriska dispensrar, två prover landar och blandas snabbt på ett nanotrådIGT EM-nät när det dyker mot kryogenen. Potentiellt kan hundratals rutnät förberedas i snabb följd från endast ett fåtal mikroliter av ett prov. Här presenteras ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för driften av Spotiton-systemet med fokus på felsökning av specifika problem som uppstår under rutnätsförberedelser.
Potentialen för cryo-EM att fånga och avslöja övergående konformations tillstånd av proteiner på sub-second tidsskalan (tidsuppfrisatt cryo-EM) har realiserats av flera grupper, med början med Berriman och Unwin1 vars teknik bygger på standard plunge frysning metod som utvecklats av Dubochet för att förbereda cryo-EM rutnät2. De lade till en finfördelare strax ovanför kryogenkoppen som använde komprimerad kvävegas för att spruta en fin dimma av ett andra prov på ett fallande EM-rutnät som innehöll ett första prov som hade applicerats och blottats till ett tunt vattenskikt. Även om detta system kunde uppnå blandningstider så låga som 1 ms, krävde det fortfarande manuell blotting av det första exemplet av användaren – en tekniskt utmanande uppgift – och en relativt hög volym av det andra exemplet. I praktiken var det dessutom svårt att veta var blandningen av de två proverna hade ägt rum, vilket krävde användning av ferritinnanopartiklar som fiducialmarkör i det blandade provet. Efterföljande ansträngningar av Howard White och medarbetare förbättrade kontrollen och reproducerbarheten av denna sprutblandningsmetod genom att införliva datorstyrning av blotting- och sprutsteg3,4. För att ta itu med hur bra och var proverna blandas harsamma grupp 5 ochandra 6,7,8,9,10 gått över till en blandningssprutningsmetod11 där två prover blandas antingen i smala kapillärrör under trycket från sprutpumpar eller i mikrofabricerade mikrofluidiska chips som drivs av kvävegas. Dessa förblandningssystem säkerställer inte bara fullständig blandning, utan gör det också möjligt att finjustera blandningstiderna för att öka upplösningen av tidsupplösta studier.
Införandet av piezoelektriska dispensrar som ett alternativt sätt att applicera prov på EM-nät i Spotitons system möjliggjorde både den exakta inriktningen på provdeponeringen och kravet på en mycket mindre provvolym för att göra ett rutnät12. Senare avlägsnade användningen av nanotrådsnät och provapplikation underväg (“on-the-fly” spotting) behovet av ett blottingsteg och minskade applicering till vitrifikation gånger13,14. För den nya metoden för tidsupplösning av cryo-EM som beskrivs här, lades en andra dispenser tillsammans med nödvändiga kontrollhårdvara och programvaruuppgraderingar till Spotiton-systemet för att möjliggöra leverans av ett andra prov till ett rörligt nanotrådnät nästan omedelbart efter deponeringen av de första15. De två överlappande proverna blandas på gallret eftersom de är onda av nanotrådarna till ett tunt vattenhaltigt lager före vitrifiering. Blandningstider så låga som 90 ms kan uppnås. Detta protokoll syftar till att ge praktisk information om hur man utför tidsupplösna experiment med hjälp av piezoelektrisk dispensering och nanotrådsnät. Eftersom maskinvaran och programvaran ändras för att förbättra användarvänligheten, konsekvensen och dataflödet fungerar detta protokoll också som en aktuell beskrivning av den tidigare rapporterade metoden15.
Detta protokoll beskriver användningen av Spotitons robotsystem för att förbereda galler för cryo-EM-avbildning som bär två prover, i allmänhet ett protein av intresse och en aktiverande ligand, som har blandats för 90-500 ms. Även om arbetsflödet är enkelt finns det några överväganden som användaren måste tänka på för att säkerställa en produktiv rutnätssession. För det första är det inte ovanligt att en av de piezoelektriska dispenserspetsarna blir igensatt eller blockerad och förhindrar att den avfyras. Ett sådant fel kommer att resultera i en flytande rand, sett på bildinspelningar från den övre eller nedre kameran, vilket är synligt smalare än det som ses efter att båda spetsarna avfyrats. En blockering kan bero på en luftbubbla som ligger i spetsen, stör droppbildningen eller från proteinprov som har torkat ut och förseglat den smala spetsöppningen. Även om det aspirerade provet går förlorat i processen, kan båda problemen lösas genom en ultraljudstvätt av spetsarna och omambition av provet. För att förhindra efterföljande igensättning och provavfall är det viktigt att noggrant prime (spola) vätskeledningarna före provambition och att upprätthålla en hög och konsekvent fuktighetsnivå i kammaren och svepningen. Dessutom kan ett proteinprov med en särskilt hög koncentration påverka spetsbränning trots väl underhållen fuktighet. Även om en ökning av avfyrningsamlituden på fliken Inspektera delvis kan kompensera för svag avfyrning på grund av hög proteinkoncentration, kommer utspädning av provet minst 1:2 att förbättra spetsbränningen och undvika igensättning.
För det andra kan det vara svårt att uppnå den idealiska hastigheten som behövs för att generera is med optimal tjocklek för den riktade blandningstiden. I allmänhet kräver snabbare blandningstider snabbare transportering, långsammare blandningstider kräver långsammare transporter. För det idealiskt onda gallret är en flytande rand tydligt urskiljbar i den övre kamerabilden, medan i den nedre kameran förblir endast en mycket liten förtjockning av gallerstängerna på randens plats synlig. Långsam korg, indikerad av en mörk rand på den nedre kamerabilden, lämnar i allmänhet is som är för tjock för avbildning. Avsaknaden av en rand på någon av bilderna indikerar snabb korg som kan ha lämnat inget vatten i hålen (Figur S5). Flera faktorer som nanotrådstäthet, plasmarengöringsinställningar och varaktighet samt exponeringstid för och inställd luftfuktighet i kammaren kan påverka hastigheten. Dålig (långsam) transportering kan vara resultatet av en gles beläggning av nanotrådar på nätet. Genom att späda ut och öka exponeringstiden för nanotrådslösningen16kommer densiteten och täckningen av nanotrådar på gallerstängerna att öka, vilket underlättar snabbare transportering. Om nanotrådens densitet är tillräcklig kommer en ökning av wattalinställningen eller varaktigheten av plasmarengöring också att förbättra transporteringen. De inställningar som rekommenderas här är relativt låg effekt och lång varaktighet, men kan ändras om det behövs.
Men om både den specifika satsen av galler och plasmarengöringsinställningar har fungerat bra under en tidigare session, kan långsam transporteringsprestanda uppstå till följd av överdriven exponering av nanotrådarna för hög luftfuktighet i kammaren, vilket leder till att de mättas med fukt och minskad vätskekapacitet. Den nätmättande effekten av kammarens luftfuktighet kan minskas genom att antingen minimera den förfallna tiden mellan pincettmontering och galler som sjunker eller minskar systemets fuktighetsnivå före ett dopp. Det bör dock noteras att den senare medför den därmed förknippade risken att spetsen laddad med proteinprov täpps till. För att kompensera denna risk kan du öka den tillåtna tiden för att montera pincett som håller ett nytt galler genom att hålla spetsarna i svepet där en hög luftfuktighet bibehålls. Slutligen bör det noteras att en minskad avsvalkningstid (uppnås genom ökad nätacceleration och/eller maximal hastighet) kan leda till galler med tunnare is utan att faktiskt ändra nätets onda egenskaper. Men eftersom blandningstiden för de två proverna också kommer att minskas, är dopptiden inte en faktor som vanligtvis ändras för att ta itu med långsam transportering. För att ta itu med transporter som är för snabba, vilket resulterar i is som antingen är för tunn eller frånvarande i gallerhålen, kan motsatsen till de åtgärder som beskrivs ovan vidtas.
Spotiton uppvisar vissa fördelar och nackdelar jämfört med andra tekniker som utvecklats för undergrupper tidsuppgjorda studier. Eftersom den blandade provremsan endast innehåller 2-4 nL vätska från varje dispenser, är en enda 3 μL alikvot av varje prov tillräcklig för att förbereda många galler – en viktig fördel när provet är begränsat. Dessutom är observation av provdeposition med integrerade kameror, även om den inte är helt unik för Spotiton17, inte en funktion av andra blandningsanordningar och gör det möjligt att utsätta kolvnät för en rå passning / misslyckad utvärdering, vilket kraftigt minskar screeningtiden. En viktig nackdel med systemet är en minsta blandningstid på 90 ms, begränsad av de mekaniska komponenternas fysiska begränsningar, som sätter förhör av snabbare biologiska reaktioner utom räckhåll. Som jämförelse uppnås gånger mindre än 10 ms rutinmässigt på befintliga mikrofluidiska system. På Spotiton-baserade, kommersiellt tillgängliga kameleontsystem har design- och konstruktionsförbättringar minskat den minsta avsvalkningstiden till 54 ms och ökar möjligheten att tillägg av en andra dispenser kan möjliggöra snabbare blandningstider än Spotiton för närvarande kan erbjuda.
Hittills har en rad experiment utförts för att undersöka tidiga, kortlivade molekylära tillstånd med Spotiton, inklusive montering av 70S ribosom, kalciumutlösta konformationsförändringar i en transmembranjonkanal och förträngning av dynamin som svar på GTP hydrolys15. Sedan dessa resultat offentliggjordes har flera ändringar införlivats i systemet för att förbättra dataflödet, reproducerbarheten och rapporteringen av Spotitons rutnätssessioner. Dessa inkluderar bland annat det dubbla zonen, det automatiska fuktövervaknings- och kontrollsystemet, experimentvisarfunktionen, inspektionsfunktionen sida vid sida och flera mindre uppgraderingar av användargränssnittet. Det uppgraderade systemet kommer bättre att stödja framtida blandningsexperiment med två prover liknande dem som tidigare rapporterats samt snabba bindande analyser som mellan en liten molekyl terapeutisk och dess proteinmål eller till och med antikroppsantigenkomplexbildning. Även om nuvarande och framtida tidsupplösna experiment med två samverkande partner säkert kommer att fortsätta, kan tillägget av en tredje piezoelektrisk dispenser och tillhörande hårdvara ytterligare bredda utbudet av möjliga experiment. Till exempel kan inledande nedfall av ett tvätt- och rengöringsmedel följt av det protein som är av intresse, följt av den interagerande eller aktiverande ligand, avlägsna eventuella negativa effekter av utökad exponering för tvättmedlet, som ofta är nödvändiga för att förhindra vanliga suboptimala bildutfall som föredragen orientering. Mot bakgrund av både det redan publicerade arbetet och potentiella framtida tillämpningar utgör Spotiton ett viktigt verktyg för cryo-EM-samhället för att underlätta genomförandet av underleverantörsstudier som är tidsupplysta.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Peter A. Kahn och Terry Rohde på Engineering Arts LLC (Arizona, USA) för inledande design och efterföljande utveckling av Spotiton-systemet. Vi tackar personalen på Simons Electron Microscopy Center vid New York Structural Biology Center för hjälp och teknisk support. Arbetet som presenterades här utfördes vid National Resource for Automated Molecular Microscopy vid New York Structural Biology Center, med stöd av bidrag från NIH (GM103310) och Simons Foundation (SF349247).
Buffer | N/A | N/A | |
cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
Protein/other sample | N/A | N/A | |
Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |