Protokollen som presenteres her beskriver bruken av Spotiton, et nytt robotsystem, for å levere to prøver av interesse på et selvtransporterende nanotrådnett som blandes i minst 90 ms før vitrifisering i flytende kryogen.
Fangsten av kortvarige molekylære tilstander utløst av det tidlige møtet av to eller flere interagerende partikler fortsetter å være en eksperimentell utfordring av stor interesse for feltet kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). Noen få metodologiske strategier er utviklet som støtter disse “tidsavklarte” studiene, hvorav den ene, Spotiton-et nytt robotsystem- kombinerer dispensering av picoliter-størrelse prøvedråper med presis tidsmessig og romlig kontroll. Den tidsavklarte Spotiton-arbeidsflyten gir en unik effektiv tilnærming for å forhøre tidlige strukturelle omorganiseringer fra minimalt utvalgsvolum. Avfyrt fra uavhengig kontrollerte piezoelektriske dispensere, to prøver lander og blander seg raskt på et nanotråd EM-rutenett når det stuper mot kryoogenet. Potensielt kan hundrevis av nett tilberedes i rask rekkefølge fra bare noen få mikroliter av en prøve. Her presenteres en detaljert trinnvis protokoll for driften av Spotiton-systemet med fokus på feilsøking av spesifikke problemer som oppstår under nettforberedelse.
Potensialet for kryo-EM til å fange og avsløre forbigående konformasjonstilstander av proteiner på under-andre tidsskala (tidsavklart kryo-EM) har blitt realisert av flere grupper, som begynner med Berriman og Unwin1 hvis teknikk bygget på standard frysingsmetode utviklet av Dubochet for å forberede cryo-EM-rutenett2. De la til en forstøver like over kryoogenkoppen som brukte komprimert nitrogengass til å sprøyte en fin tåke av en annen prøve på et stupt EM-rutenett som inneholdt en første prøve som hadde blitt påført og blottet til et tynt vandig lag. Selv om dette systemet kunne oppnå blandetider så lave som 1 ms, krevde det fortsatt manuell oppblåsthet av den første prøven av brukeren – en teknisk utfordrende oppgave – og et relativt høyt volum av den andre prøven. Videre var det i praksis vanskelig å vite hvor blanding av de to prøvene hadde skjedd, noe som krevde bruk av ferritin nanopartikler som en fiducial markør i den blandede prøven. Etterfølgende innsats fra Howard White og medarbeidere forbedret kontroll og reproduserbarhet av denne sprøyteblandingsmetoden ved å inkorporere datakontroll av oppblåsthets- og sprøytetrinnene3,4. For å adressere hvor godt og hvor prøvene blandes, har samme gruppe5 og andre6,7,8,9,10 flyttet til en blandingssprøytemetode11 der to prøver blandes enten i smale kapillære rør under trykk av sprøytepumper eller i mikrofabricated, mikrofluidic chips drevet av nitrogengass. Disse forblandingssystemene sikrer ikke bare fullstendig blanding, men gjør det også mulig å finjustere blandetidene for å øke oppløsningen av tidsavklarte studier.
Innføringen av piezoelektriske dispensere som en alternativ måte å bruke prøve på EM-rutenett i Spotiton-systemet gjorde det mulig med både presis målretting av prøveavsetning og kravet om et mye mindre prøvevolum for å lage et rutenett12. Senere fjernet bruken av nanotrådgitter og underveis prøveprogram (“on-the-fly” spotting) behovet for et blottingstrinn og redusert applikasjons-til-vitrifisering ganger13,14. For den nye tilnærmingen til tids løst cryo-EM beskrevet her, ble en annen dispenser sammen med de nødvendige kontrollmaskinvare- og programvareoppgraderingene lagt til Spotiton-systemet for å muliggjøre levering av en annen prøve på et bevegelig nanotrådnett nesten umiddelbart etter avsetning av de første15. De to overlappende prøvene blandes på rutenettet da de er onde av nanotrådene i et tynt vandig lag før vitrifisering. Blandetider så lave som 90 ms kan oppnås. Denne protokollen har til hensikt å gi praktisk informasjon om hvordan man utfører tidsavklarte eksperimenter ved hjelp av piezoelektriske dispenserings- og nanotrådnett. I tillegg, etter hvert som maskinvaren og programvaren endres for å forbedre brukervennligheten, konsekvensen og gjennomstrømningen, fungerer denne protokollen også som en oppdatert beskrivelse av den tidligere rapporterte metoden15.
Denne protokollen skisserer bruken av Spotiton robotsystem for å forberede rutenett for kryo-EM-avbildning som bærer to prøver, vanligvis et protein av interesse og en aktiverende ligand, som har blitt blandet i 90-500 ms. Selv om arbeidsflyten er enkel, er det noen få hensyn brukeren må huske på for å sikre en produktiv rutenettøkt. For det første er det ikke uvanlig at en av de piezoelektriske dispenserspissene blir tilstoppet eller blokkert for å forhindre at den avfyres. En slik feil vil resultere i en flytende stripe, sett på bildeopptak fra øvre eller nedre kamera, noe som er synlig smalere enn det som er sett etter at begge tipsene ble avfyrt. En blokkering kan skyldes en luftboble som ligger i spissen, forstyrrer dråpeformasjonen, eller fra proteinprøve som har tørket ut og forseglet den smale spissåpningen. Selv om den aspirerte prøven går tapt i prosessen, kan begge problemene løses ved en ultralydvask av spissene og re-aspirasjon av prøven. For å forhindre etterfølgende tilstopping og prøveavfall, er det avgjørende å klargjøre (skylle) væskelinjene grundig før prøveaspirasjon og opprettholde et høyt og konsistent fuktighetsnivå i kammeret og dekselet. I tillegg kan en proteinprøve med en spesielt høy konsentrasjon påvirke spissfyring til tross for godt vedlikeholdt fuktighet. Selv om økning av avfyringsamplituden på inspeksjonsfanen delvis kan kompensere for svak avfyring på grunn av høy proteinkonsentrasjon, vil fortynning av prøven minst 1:2 forbedre spissavfyring og unngå tilstopping.
For det andre kan det være vanskelig å oppnå den ideelle fukttransporterende hastigheten som trengs for å generere is med optimal tykkelse for den målrettede blandevarigheten. Generelt vil raskere blandetider kreve raskere fukttransporterende, langsommere blandetider krever langsommere fukttransport. For det ideelt onde rutenettet er en flytende stripe tydelig merkbar i det øvre kamerabildet, mens i det nedre kameraet forblir bare en veldig liten fortykning av rutenettstengene i plasseringen av stripen synlig. Langsom fukttransport, indikert med en mørk stripe på det nedre kamerabildet, etterlater vanligvis is som er for tykk for avbildning. Fravær av stripe på et av bildene indikerer rask fukttransport som kanskje ikke har etterlatt vann i hullene (Figur S5). Flere faktorer som nanotrådtetthet, plasmarengjøringsinnstillinger og varighet, og tid for eksponering for og angitt nivå av kammerfuktighet kan påvirke fukttransporterende hastighet. Dårlig (langsom) fukttransport kan være et resultat av et sparsomt belegg av nanotråder på rutenettet. Ved å fortynne og øke eksponeringstiden for nanotrådløsningen16litt, vil tettheten og dekningen av nanotråder på rutenettstengene øke, noe som letter raskere fukttransport. Hvis nanotrådtettheten er tilstrekkelig, vil det også forbedre fukttransporten hvis du øker wattstyrkeinnstillingen eller varigheten av plasmarengjøring. Innstillingene som anbefales her, har relativt lav effekt og lang varighet, men kan endres om nødvendig.
Imidlertid, hvis både den spesifikke batchen av rutenett og plasmarengjøringsinnstillinger har fungert bra i en tidligere økt, kan langsom fuktytelse oppstå ved overdreven eksponering av nanotrådene til høy luftfuktighet i kammeret, noe som fører til metning med fuktighet og redusert væskeholdingskapasitet. Den rutenettmetningseffekten av kammerfuktighet kan reduseres ved enten å minimere den forløpte tiden mellom pinsettmontering og gitter som stuper eller reduserer systemets fuktighetsnivå før et stup. Det skal imidlertid bemerkes at sistnevnte bringer den tilknyttede risikoen for at spissen lastet med proteinprøve vil tette. For å kompensere for denne risikoen, kan det å holde spissene i dekselet der et høyt fuktighetsnivå opprettholdes, øke den tillatte tiden for å montere pinsett som holder et nytt rutenett. Til slutt bør det bemerkes at redusert stupetid (oppnådd ved å øke rutenettakselerasjonen og / eller maksimal hastighet) kan resultere i rutenett med tynnere is uten å endre de fuktende egenskapene til rutenettet. Men ettersom blandingstiden til de to prøvene også vil bli redusert, er ikke dykktid en faktor som vanligvis endres for å håndtere langsom fukttransport. For å adressere fukttransport som er for rask, noe som resulterer i is som enten er for tynn eller fraværende i rutenetthullene, kan det motsatte av tiltakene som er skissert ovenfor, tas.
Spotiton presenterer visse fordeler og ulemper sammenlignet med andre teknikker utviklet for subsecond tidsavklarte studier. Siden den blandede prøvestripen bare inneholder 2-4 nL væske fra hver dispenser, er en enkelt 3 μL aliquot av hver prøve tilstrekkelig til å forberede mange rutenett – en viktig fordel når prøven er begrenset. I tillegg er observasjon av prøveavsetning ved hjelp av integrerte kameraer, men ikke helt unik for Spotiton17, ikke en funksjon av andre mikseenheter og gjør at stupte rutenett kan bli utsatt for en grov bestått / mislykket evaluering, noe som reduserer screeningtiden sterkt. En viktig ulempe ved systemet er en minimum blandingstid på 90 ms, begrenset av de fysiske begrensningene til de mekaniske komponentene, som setter avhør av raskere biologiske reaksjoner utenfor rekkevidde. Til sammenligning oppnås ganger mindre enn 10 ms rutinemessig på eksisterende mikrofluidiske systemer. På det Spotiton-baserte, kommersielt tilgjengelige kameleonsystemet har design- og konstruksjonsforbedringer redusert minimum stupetid til 54 ms og øker muligheten for at tillegg av en annen dispenser kan tillate raskere blandetider enn Spotiton for tiden kan tilby.
Til dags dato har det blitt utført en rekke eksperimenter for å undersøke tidlige, kortvarige molekylære tilstander ved hjelp av Spotiton, inkludert montering av 70S ribosomet, kalsiumutløste konformasjonsendringer i en transmembranionkanal og innsnevring av dynamin som svar på GTP hydrolyse15. Siden publiseringen av disse resultatene har flere endringer blitt innlemmet i systemet for å forbedre gjennomstrømningen, reproduserbarheten og rapporteringen av Spotiton-nettproduksjonsøkter. Disse inkluderer blant annet dual-zone, automatisk fuktighetsovervåking og kontrollsystem, eksperimentviserfunksjonen, side-ved-side tipsinspeksjonsfunksjonen og flere mindre oppgraderinger til brukergrensesnittet. Det oppgraderte systemet vil bedre støtte fremtidige to-prøve blandingseksperimenter som ligner de tidligere rapporterte, samt raske bindende analyser som mellom et lite molekylterapeutisk og proteinmålet eller til og med antistoff-antigenkompleksdannelse. Mens nåværende og fremtidige tidsavklarte eksperimenter som involverer to interagerende partnere sikkert vil fortsette, kan tillegg av en tredje piezoelektrisk dispenser og tilhørende maskinvare ytterligere utvide spekteret av mulige eksperimenter. For eksempel kan innledende avsetning av et vaskemiddel etterfulgt av proteinet av interesse, etterfulgt av den interagerende eller aktiverende liganden fjerne potensiell negativ innvirkning av utvidet eksponering for vaskemiddelet, ofte nødvendig for å forhindre vanlige suboptimale bildebehandlingsresultater som foretrukket orientering. I lys av både det allerede publiserte arbeidet og potensielle fremtidige applikasjoner, representerer Spotiton et viktig verktøy for cryo-EM-samfunnet for å lette gjennomføringen av undersecond tidsavklarte studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke Peter A. Kahn og Terry Rohde hos Engineering Arts LLC (Arizona, USA) for første design og påfølgende utvikling av Spotiton-systemet. Vi takker de ansatte ved Simons Electron Microscopy Center ved New York Structural Biology Center for hjelp og teknisk støtte. Arbeidet som presenteres her ble utført ved National Resource for Automated Molecular Microscopy lokalisert ved New York Structural Biology Center, støttet av tilskudd fra NIH (GM103310) og Simons Foundation (SF349247).
Buffer | N/A | N/A | |
cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
Protein/other sample | N/A | N/A | |
Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |