El protocolo tiene como objetivo proporcionar un método estándar para la vitrificación de ovocitos de ovejas adultas y juveniles. Incluye todos los pasos desde la preparación de los medios de maduración in vitro hasta el cultivo post-calentamiento. Los ovocitos se vitrifican en la etapa de MII utilizando Cryotop para asegurar el volumen mínimo esencial.
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Artículo de método
Vitrificación De Ovocitos Maduros In Vitro Recogidos De Ovarios Adultos Y Prepúrromos En Ovejas
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Resumen
Resumen
En el ganado, los sistemas de producción de embriones in vitro se pueden desarrollar y mantener gracias a la gran cantidad de ovarios y ovocitos que se pueden obtener fácilmente de un matadero. Los ovarios adultos siempre llevan varios folículos antrales, mientras que en los donantes prepúerales los números máximos de ovocitos están disponibles a las 4 semanas de edad, cuando los ovarios tienen un número máximo de folículos antrales. Así, los corderos de 4 semanas de edad se consideran buenos donantes, incluso si la competencia de desarrollo de los ovocitos prepúrromos es menor en comparación con su contraparte adulta.
La investigación básica y las aplicaciones comerciales se verían impulsadas por la posibilidad de criopreservar con éxito ovocitos vitrificados obtenidos de donantes adultos y prepúterrales. La vitrificación de los ovocitos recogidos de donantes prepúrromos también permitiría acortar el intervalo de generación y, por lo tanto, aumentar la ganancia genética en los programas de cría. Sin embargo, la pérdida de potencial de desarrollo después de la criopreservación hace que los ovocitos de mamíferos sean probablemente uno de los tipos celulares más difíciles de criopreservar. Entre las técnicas de criopreservación disponibles, la vitrificación se aplica ampliamente a los ovocitos animales y humanos. A pesar de los avances recientes en la técnica, las exposiciones a altas concentraciones de agentes crioprotectores, así como lesiones escalofriantes y estrés osmótico todavía inducen varias alteraciones estructurales y moleculares y reducen el potencial de desarrollo de los ovocitos de mamíferos. Aquí, se describe un protocolo para la vitrificación de ovocitos de oveja recogidos de donantes juveniles y adultos y madurados in vitro antes de la criopreservación. El protocolo incluye todos los procedimientos desde la maduración in vitro de ovocitos hasta la vitrificación, el calentamiento y el período de incubación post-calentamiento. Los ovocitos vitrificados en la etapa de MII de hecho pueden ser fertilizados después del calentamiento, pero necesitan tiempo extra antes de la fertilización para restaurar el daño debido a los procedimientos de criopreservación y para aumentar su potencial de desarrollo. Por lo tanto, las condiciones de cultivo posteriores al calentamiento y el momento son pasos cruciales para la restauración del potencial de desarrollo de ovocitos, especialmente cuando los ovocitos se recolectan de donantes juveniles.
Introducción
El almacenamiento a largo plazo de los gametos femeninos puede ofrecer una amplia gama de aplicaciones, como la mejora de la cría de animales domésticos mediante programas de selección genética, la contribución a la preservación de la biodiversidad a través del programa de conservación de especies silvestres ex situ, y el impulso de la investigación y las aplicaciones biotecnológicas in vitro gracias a la disponibilidad de ovocitos almacenados para ser incorporados en la producción de embriones in vitro o en los programas de trasplante nuclear1,2,3. La vitrificación de ovocit....
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Protocolo
El protocolo animal y los procedimientos implementados que se describen a continuación están de acuerdo con las directrices éticas vigentes en la Universidad de Sassari, en cumplimiento de la Directiva 86/609/CE de la Unión Europea y la recomendación de la Comisión de las Comunidades Europeas 2007/526/CE.
1. Preparación de medios para la manipulación de ovocitos
- Prepare el medio para el transporte de los ovarios recolectados complementando la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con 0,1 g/L de penicilina y 0,1 g/L de estreptomicina (PBS).
- Preparar el medio para la recolección y maduración de ovocitos diluyen....
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Resultados
La criotolerance de los ovocitos de donantes juveniles es menor en comparación con los adultos. El primer efecto observado es una menor tasa de supervivencia post-calentamiento en comparación con los ovocitos adultos(Figura 1A;χ2 prueba P<0,001). Los ovocitos juveniles mostraron una menor integridad de la membrana después del calentamiento (Figura 1B). El uso de trehalosa en el medio de maduración tenía como objetivo verificar si este azúcar podría.......
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Discusión
La criopreservación de ovocitos en animales domésticos puede permitir no sólo la conservación a largo plazo de los recursos genéticos femeninos, sino también avanzar en el desarrollo de biotecnologías embrionarias. Por lo tanto, el desarrollo de un método estándar para la vitrificación de ovocitos beneficiaría tanto al ganado como al sector de la investigación. En este protocolo, un método completo para la vitrificación adulta del oocyte de las ovejas se presenta y podría representar un punto de partida sólido para el de.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores no recibieron financiación específica para este trabajo. La profesora Maria Grazia Cappai y la Dra. Valeria Pasciu son agradecidas por la voz en off en video y por configurar el laboratorio durante la realización del video.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2′,7′-Diacetato de diclorofluorescina | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albúmina fracción bovina V, libre de proteasa | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimida H 33342 triclorhidrato (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Cloruro de calcio (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Ácido cítrico | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Microscopio de barrido láser confocal | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructosa | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalosa deshidratada | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Fosfato tamponado solución salina | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Yema de huevo | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Etilenglicol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Ácido glutámico | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehído | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glicina | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparina | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Microscopio invertido | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanina | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginina | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagina | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Ácido Aspártico | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cisteína | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cistina | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamina | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidina | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucina | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucina | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lisina | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Metionina | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornitina | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Fenilalanina | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Prolina | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serina | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-tirosina | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-valina | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Cloruro de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Cámara de recuento | Sefi-Medical Instruments ltd. Biosigma S.r.l. | ||
| Medio 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Aceite mineral | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Rojo CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| Suero de ternero recién nacido inactivado por calor (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicilina G sal sódica | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Fenol Rojo | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Alcohol polivinílico (87-90% hidrolizado, peso mol medio 30.000-70.000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Cloruro de potasio (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Yoduro de propidio | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Suero de oveja | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Azida de sodio | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Bicarbonato de sodio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Jarabe de solución de dl-lactato de sodio | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Piruvato de sodio | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Analizador de Clases de Esperma | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Software estadístico Minitab 18.1 | 2017 Microscopio | ||
| Olimpus | SZ61 | ||
| Sulfato de estreptomicina | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurina | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
Referencias
- Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012). <....
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Reimpresiones y permisos
