Detta protokoll visar hur man avbildar biologiska kryobevarade prover med kryostrukturerad belysningsmikroskopi. Vi visar metodiken genom att avbilda cytoskeleton av U2OS celler.
Tredimensionell (3D) strukturerad belysningsmikroskopi (SIM) möjliggör avbildning av fluorescerande märkta cellulära strukturer med högre upplösning än konventionell fluorescensmikroskopi. Denna superupplösningsteknik (SR) möjliggör visualisering av molekylära processer i hela celler och har potential att användas tillsammans med elektronmikroskopi och röntgentomografi för att korrelera strukturell och funktionell information. Ett SIM-mikroskop för kryogent bevarade prover (cryoSIM) har nyligen beställts på den korrelativa kryo-bildstrålelinjen B24 vid den brittiska synkrotronen.
Det utformades speciellt för 3D-avbildning av biologiska prover vid kryogena temperaturer på ett sätt som är förenligt med efterföljande avbildning av samma prover med röntgenmikroskopimetoder som kryo-mjuk röntgentomografi. Den här videoartikeln innehåller detaljerade metoder och protokoll för framgångsrik avbildning med cryoSIM. Förutom instruktioner om hur cryoSIM-mikroskopet ska fungera har rekommendationer inkluderats om valet av prover, fluorforer och parameterinställningar. Protokollet visas i U2OS-cellprover vars mitokondrier och tubulin har märkts fluorescerande.
SR-bildteknik har blivit allmänt tillgänglig för biologer under det senaste decenniet1. De tillåter högupplöst bildbehandling av fluorescerande märkta prover utöver diffraktionsgränsen. Det har dock varit utmanande att anpassa SR-mikroskopimetoder för att arbeta med prover vid kryogena temperaturer2. Detta skulle vara fördelaktigt för korrelativ avbildning i kombination med elektron eller röntgentomografi. Nyligen har SIM anpassats för användning med kryogena prover och har framgångsrikt visat sig möjliggöra korrelativa studier av biologiska celler i samband med mjuk röntgentomografi (SXT)3 vid den korrelativa kryo-bildstrålelinjen B24 vid Diamond Light Source Synchrotron (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM kan fördubbla upplösningen av konventionell bredfältsmikroskopi genom att belysa provet med randiga ljusmönster (Moiré fransar) i tre vinklar och i fem faser. Interferensen mellan dessa ljusmönster och provfluorescensen kan användas för att beräkningsmässigt avslöja extra information om subdiffraktionsstrukturer4,5.
Det finns flera fördelar med SIM jämfört med andra SR-tekniker för kryogena applikationer. För det första kan det fungera utan speciellt utformade blinkande fluorforer; konventionella fluorforer kan användas, vilket ger tillgång till ett bredare spektrum av potentiella fluorescerande taggningsmedel6. Dessutom kräver det bara 15 bilder per z-skiva (i 3D; 9 bilder för 2D), medan andra SR-metoder tar cirka 1000 bilder per skiva, vilket ökar risken för att provet värms upp och därmed ökar risken för iskristallbildning, vilket kan orsaka artefakter. Slutligen kan denna teknik avbilda tjockare biologiska prover på över 10 μm, så att hela celler kan avbildas i sitt nästan inhemska tillstånd6. CryoSIM har byggts med hjälp av optiska standardkomponenter och med programvara för öppen åtkomst för avbildning, vilket gör det enkelt att dokumentera och duplicera om så önskas6. CryoSIM har ett 100x/0,9 numeriskt bländarmål (se materialförteckningen); Ytterligare information om dess optiska komponenter, designparametrar och prestanda har beskrivits av Phillips et al.6 Här visar detta protokoll hur man använder cryoSIM-mikroskopet, inklusive hur man laddar och lossar prover på det kryogena stadiet, hur man samlar in data på mikroskopet och hur man rekonstruerar SIM-bilderna.
3D SIM vid kryogena temperaturer har många fördelar jämfört med andra SR-bildtekniker för avbildning av förkrossat biologiskt material. Det kräver betydligt färre bilder per z-skiva jämfört med andra SR-metoder, vilket resulterar i mindre bestrålning och en lägre risk för iskristallbildning för förglasade prover. Det kan också avbilda hela celler och kan korreleras med röntgentomografi för att matcha struktur med funktion. Intressant nog bleker de flesta kommersiellt tillgängliga fluorforer och fluorescenstaggar mindre under kryogena förhållanden än vid rumstemperatur. Men med tanke på det höga kvantutbytet hos de vanligaste fluorforerna vid rumstemperatur (mer än 80% i vissa fall) beror den absoluta vinsten som upptäcks i fotoner inte på förändringar i kvantutbytet, utan på en minskning av de komplexa blekningsprocesserna. Mer information om utbytet av fluorforer vid kryogena temperaturer finns i 8.
Det är viktigt att prover som anländer till cryoSIM har förmappats med hjälp av ett konventionellt cryofluorescensmikroskop med brightfield-kapacitet för att producera ett rutnät “karta” som inkluderar markering av alla potentiella AOIs för ytterligare avbildning (Figur 5). Tillträdestiden vid cryoSIM fördelas via en konkurrensprocess som innebär att ett förslag lämnas in, som därefter utvärderas för teknik genomförbarhet och biomedicinsk påverkan. Tiden på utrustningen är därför alltid “till en premie”, och förmappade rutnät möjliggör den mest effektiva användningen av en tilldelning. Det är också viktigt att provet hålls förglasat, särskilt under provöverföring från provhållaren till bildplattformen, för att minimera bildandet av iskristaller och efterföljande provskador. Provet bör vara av god kvalitet för att producera de bästa SIM-bilderna. Ett väl förberett prov kommer att kännetecknas av följande egenskaper: a) det kommer inte att ha någon iskristallförorening, b) det använda gallret kommer att vara ett findernät, (c) bäraren kommer att vara platt, d) nätnätet och substratytan kommer inte att vara automatisk fluorescerande, och e) det kommer inte att finnas några avbrott i stödmembranet. Dessa förutsättningar kan uppnås genom noggrann provhantering och säkerställande av att proverna alltid förblir förförligade.
Det är viktigt att kontrollera i förväg om föreslagna provfluorforer kommer att ge tillräckligt med signal i cryoSIM-mikroskopet. Verktyg som SPEKCheck9 kan hjälpa till med att välja optimal fluorfor och filterkombinationer. Om det finns problem med rådatainsamlingen eller rekonstruktionsprocessen kan artefakter visas i bilderna efter rekonstruktionen. Exempel på olika artefakter har dokumenterats av Demmerle et al.10 Parametrarna för bildrekonstruktion kan ses över i SoftWoRx-loggfilen om rekonstruktionen inte är optimal genom att öppna sammanfattningsfilen för rekonstruktion. Det bör finnas konsekvent linjeavstånd över vinklar i en viss kanal och relativt konsekvent amplitud. Variation på mer än 30% och värden som ligger betydligt över 1 (om ersättning för pärlstorlek tillämpas) bör undersökas närmare och kommer sannolikt att indikera misslyckade rekonstruktioner. Dessutom kan SIMcheck2-programvaran i Fiji också användas för att utföra olika kontroller av råa och rekonstruerade data för att diagnostisera orsaken till fel i bild- eller rekonstruktionsparameterinställningarna. SIM-kontroll och dess kontrastkarta för modulering kan också bidra till bedömningen av kvaliteten på rekonstruerade data genom att tolka vilka områden i en bild som sannolikt kommer att vara verkliga strukturer kontra artefakter.
Låg moduleringskontrast (visas med mörk färg, i figur 5E)inom kärnområdet innebär att denna region kommer att vara mer mottaglig för rekonstruktionsartefakter, vilket innebär att hashmönstren som visas i kärnan kan klassificeras (figur 5D) som en artefakt. Starka fluorescenssignalområden är mer benägna att korrekt återspegla inhemska strukturer i de bearbetade data. I områden med svag signal där fluorforer fördelas över större områden, såsom den totala ytan på en blåsor, är det troligt att verkliga signaler samexisterar med bearbetningsföremål, och försiktighet bör vidtas vid tolkningen av dessa data. Efter inspektion av rekonstruerade data i full räckvidd för att säkerställa att det inte finns några konstiga artefakter, och att bakgrunden i allmänhet är gaussisk och centrerad nära noll, klipps data i allmänhet på noll, eller det modala värdet – toppen av bakgrundssignalen – bör vara mycket nära noll. Detta säkerställer att det dynamiska området för den visade bilden inte domineras av negativa bakgrundsartefakter. När en svagare signal förväntas bör extra försiktighet tas för att analysera funktionerna och se till att de är verkliga strukturer snarare än rekonstruktionsföremål.
Det finns vissa begränsningar i bildsystemet. Eftersom provsteget är platt är prover med variabel tjocklek eller rutnät som inte är platta inte idealiska motiv för avbildning. Dessutom, om korrelativ avbildning kommer att göras med hjälp av mjuk röntgentomografi, bör celler nära rutnätsgränser inte avbildas eftersom dessa inte kommer att synas i röntgenmikroskopet under förvärvet av tiltserien. Slutligen har mängden blotting av provet före frysning av dyk en betydande inverkan på bildframställningens kvalitet. för lite blotting resulterar i prover som är för tjocka, vilket ger suboptimala SIM-bilder med högt bakgrundsljud, medan för mycket blotting kan orsaka att celler blir felhaped och därför mer mottagliga för värmeskador från tillbudslaserstrålen. Sammanfattningsvis är cryoSIM ett kraftfullt fluorescensmikroskopiverktyg för avbildning av biologiska prover i 3D i ett nästan inhemskt stadium och har omfattande tillämpningar inom många områden.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt har fått finansiering från Europeiska kommissionens Horisont 2020 iNEXT-Discovery-projekt. I.M. Dobbie bekräftar finansiering från Wellcome Trust (107457/Z/15/Z). Detta arbete utfördes med stöd av Diamond Light Source, instrument B24 (förslag BI25512). Vårt tack till personalen på Micron och alla våra utmärkta användare och samarbetspartners för att hjälpa oss att etablera cryoSIM och dess korrelativa potential.
Auto grids | FEI | ||
Autogrids | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | |
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Sigma-Aldrich | SCT142 | |
Cockpit Software | Oxford University | https://github.com/MicronOxford/cockpit | |
cryo compatible polyurethane container | Jena bioscience | CC-FD-800 | |
Cryo TEM grid storage box | Thermo Fisher Scientific | Model#AutoGrid | |
cryo-SIM microscope | Custom made | N/A | Custom made, see following reference for the design: Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA. |
Cryostage system | Linkam Scientific Instruments | CMS196 | |
Fine tip surgical forceps | Ted Pella | 38125 | |
MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
Python Microscope Software | Oxford University | https://www.python-microscope.org/ | |
Scientific dry paper wipes | Kimberly-Clark 7551 | 2 | |
SIM Reconstruction Software | softWoRx, GE Healthcare | Version 6.5.2 | |
StitchM Software | Diamond Light Source | https://github.com/DiamondLightSource/StitchM | |
TEM grids for samples | Quantifoil Micro Tools | G200F1 |