طريقة تلقيح سهلة ومرنة لتقييم الأنماط الظاهرية لعدوى البياض الدقيقي للأرابيدوبسيس والنباتات الأخرى بدقة
Summary
نقدم بروتوكولا لبناء نظام توزيع بوغ بسيط يتكون من صندوق تلقيح بشبكة ~ 50 ميكرومتر وغرفة بلاستيكية شفافة. يمكن استخدام هذا لتلقيح النباتات بالتساوي بجراثيم البياض الدقيقي ، وبالتالي تمكين التقييم الدقيق والقابل للتكرار للأنماط الظاهرية للأمراض للنباتات قيد الدراسة.
Abstract
يتطلب الحد من خسائر المحاصيل بسبب الأمراض الفطرية فهما أفضل للآليات التي تحكم مناعة النبات والتسبب في الأمراض الفطرية ، الأمر الذي يتطلب بدوره التحديد الدقيق للأنماط الظاهرية للأمراض للنباتات عند الإصابة بممرض فطري معين. ومع ذلك ، فإن التنميط الظاهري الدقيق للأمراض مع مسببات الأمراض الفطرية الحيوية غير القابلة للزراعة مثل البياض الدقيقي ليس من السهل تحقيقه ويمكن أن يكون خطوة تحد من معدل مشروع بحثي. هنا ، قمنا بتطوير نظام تنميط ظاهري آمن وفعال وسهل التشغيل للمرض باستخدام تفاعل Arabidopsis مع البياض الدقيقي كمثال. يتكون هذا النظام بشكل أساسي من ثلاثة مكونات: (i) صندوق تلقيح خشبي مزود بغطاء قابل للإزالة مثبت بشبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ أو النايلون من مسام ~ 50 ميكرومتر لتلقيح شقة من النباتات ذات الجراثيم الفطرية ، (ii) غرفة بلاستيكية شفافة ذات فتحة أمامية صغيرة لتقليل هروب البوغ أثناء إجراء التلقيح بالداخل ، و (ج) طريقة إزاحة البوغ وتوزيعها من أجل التلقيح المتساوي والفعال. تتضمن البروتوكولات الموضحة هنا الخطوات والمعلمات لصنع صندوق التلقيح والغرفة البلاستيكية بتكلفة منخفضة ، وعرض فيديو لكيفية استخدام النظام لتمكين التلقيح المتساوي بجراثيم البياض الدقيقي ، وبالتالي تحسين دقة وتكرار التنميط الظاهري للمرض.
Introduction
البياض الدقيقي هو واحد من أكثر الأمراض شيوعا وأهمية للعديد من المحاصيل الغذائية ونباتات الزينة1. حظيت دراسات أمراض البياض الدقيقي بشعبية كبيرة ، كما يتضح من أكثر من 10500 منشور كنتيجة بحث مع “البياض الدقيقي” ككلمة رئيسية في Web of Science (اعتبارا من نوفمبر 2020). في الواقع ، يعتبر البياض الدقيقي (الذي يمثله Blumeria graminis) أحد أفضل 10 مسببات الأمراض الفطرية من قبل مجلة Molecular Plant Pathology2. يعد القياس الكمي للحساسية للأمراض خطوة ضرورية في توصيف الجينات النباتية التي تساهم في مقاومة الأمراض أو قابليتها للإصابة ، أو التحديد الوظيفي للجينات المستجيبة المرشحة في البياض الدقيقي. ومع ذلك ، فإن التنميط الظاهري الموثوق به للأمراض أكثر صعوبة بكثير مع البياض الدقيقي مقارنة بمعظم مسببات الأمراض الفطرية الأخرى ، ويرجع ذلك جزئيا إلى أنه ، على عكس جراثيم الأخير ، تظهر جراثيم أنواع البياض الدقيقي (مثل Golovinomyces cichoracearum UCSC1 بناء على تجربتنا المعملية) قابلية أقل للحياة بعد المرور بعملية تعليق مائي 3,4 . قد يؤدي التلقيح غير الكافي و / أو غير المتكافئ لنباتات الاختبار بممرض البياض الدقيقي إلى نتائج تنميط ظاهري غير دقيقة.
تم الإبلاغ عن عدد من طرق التلقيح لدراسات البياض الدقيقي. وتشمل هذه (i) تنظيف الجراثيم مباشرة من الأوراق المصابة لاختبار النباتات5 ، (ii) رش معلق بوغ لاختبار النباتات6 ، (iii) نفخ الجراثيم باستخدام برج ترسيب يعمل بالفراغ للنباتات الموجودة في أسفل البرج7 ، و (iv) تسليم البوغ عن طريق الاستخدام التوافقي لغشاء شبكة نايلون والاهتزاز القائم على الصوت8 . طريقة تنظيف الأبواغ (أو الغبار) سهلة الأداء ولكنها غير متساوية بطبيعتها ، وبالتالي قد لا تكون دقيقة للتقييم الكمي. يعد رش البوغ مريحا وحتى ، ولكن كما هو مذكور أعلاه قد يؤدي إلى ضعف إنبات البوغ4. والطريقتان الأخيرتان (أي من الثالث إلى الرابع) هما طريقتان محسنة كثيرا وقادرتان على تحقيق التلقيح المتساوي؛ ومع ذلك ، فإن كلاهما ليس مرنا في تعديل قدرة التلقيح الخاصة بهما من حيث عدد النباتات التي سيتم تلقيحها في حدث واحد ، مما يجعل أيا من الجهازين ليس تافها ، ويقتصر تشغيلهما على مناطق المختبر حيث يوجد فراغ و / أو مصدر كهرباء.
يعمل مختبرنا مع تفاعل البياض الدقيقي النباتي لأكثر من 20 عاما 9,10. على مدى العقد الماضي ، اختبرنا عددا من طرق التلقيح وطورنا مؤخرا طريقة بسيطة وفعالة لتلقيح البياض الدقيقي. يمكن أن تضمن طريقة تنظيف الأبواغ القائمة على الشبكة تلقيحا متساويا ، وهي بسيطة وقابلة للتطوير ، وبالتالي يجب اعتمادها بسهولة من قبل أي مختبر يعمل مع البياض الدقيقي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتميز طريقة التلقيح القائمة على الصندوق الشبكي لدينا بالعديد من المزايا مقارنة بطرق التلقيح الأخرى. أولا ، يمكن أن يحقق توزيعا متساويا للجراثيم إذا تم تشغيله بشكل صحيح ، كما هو موضح في الشكل 5. ثانيا ، يمكن أن يؤدي استخدام شبكة ~ 50 ميكرومتر ، بالإضافة إلى إزاحة البوغ عن طريق …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (IOS-1901566) إلى S. Xiao. يود المؤلفون أن يشكروا F. Coker و C. Hooks على صيانة مرفق نمو النبات ، وخورخي زامورا على المساعدة الفنية المرتبطة بتصنيع صندوق التلقيح والغرفة.
Materials
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32×3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32×1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
References
- Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
- Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
- Sitterly, W. R., Spencer, D. M. . Powdery Mildews. , 369 (1978).
- Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
- Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
- Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
- Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
- Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
- Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
- Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).
