Protocolos de PCR digital de gotas con transcripción inversa de dos pasos para la detección y cuantificación del SARS-CoV-2
Summary
Este trabajo resume los pasos para desarrollar diferentes ensayos para la detección del SARS-CoV-2 utilizando un sistema ddPCR de dos colores. Los pasos son elaborados y se han incluido notas sobre cómo mejorar los ensayos y el rendimiento del experimento. Estos ensayos se pueden utilizar para múltiples aplicaciones RT-ddPCR del SARS-CoV-2.
Abstract
El diagnóstico de la actual pandemia de SARS-CoV-2 es una prioridad para todos los países del mundo. Actualmente, la PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) es el estándar de oro para el diagnóstico del SARS-CoV-2, ya que no hay una solución permanente disponible. Por muy efectiva que pueda ser esta técnica, han surgido investigaciones que muestran sus limitaciones en la detección y el diagnóstico, especialmente cuando se trata de objetivos poco abundantes. Por el contrario, se ha demostrado que la PCR digital por gotas (ddPCR), una tecnología emergente reciente con ventajas superiores a la qPCR, supera los desafíos de la RT-qPCR en el diagnóstico del SARS-CoV-2 a partir de muestras objetivo poco abundantes. Prospectivamente, en este artículo, las capacidades de RT-ddPCR se amplían aún más al mostrar los pasos sobre cómo desarrollar ensayos simplex, dúplex, mezcla de sonda triplex y cuádruples utilizando un sistema de detección de dos colores. Usando cebadores y sondas dirigidas a sitios específicos del genoma del SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 y RBD2), se demuestra que el desarrollo de estos ensayos es posible. Además, se proporcionan protocolos detallados paso a paso, notas y sugerencias sobre cómo mejorar el flujo de trabajo de ensayos y analizar datos. La adaptación de este flujo de trabajo en trabajos futuros garantizará que el número máximo de objetivos se pueda detectar con sensibilidad en una muestra pequeña, lo que mejorará significativamente el costo y el rendimiento de la muestra.
Introduction
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una técnica bien reconocida, ha sufrido varias transformaciones desde su advenimiento para convertirse en una técnica poderosa capaz de proporcionar respuestas a la investigación de ácidos nucleicos. Estas transformaciones han sido una mejora constante de la vieja técnica. Estas transformaciones se pueden resumir en tres generaciones1. La primera generación es la PCR convencional que se basa en la electroforesis en gel para cuantificar y detectar objetivos amplificados. La segunda generación es la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) que puede detectar muestras en tiempo real y basarse en una curva estándar para cuantificar directamente los objetivos en una muestra. La tercera generación, la PCR digital (dPCR), puede realizar tanto la detección como la cuantificación absoluta de objetivos de ácidos nucleicos sin necesidad de una curva estándar. La dPCR también se ha mejorado aún más a partir de cámaras de reacción separadas por los pozos de una pared en emulsiones de aceite, agua y productos químicos estabilizadores dentro del mismo pozo, como se ve en laPCR digital 2 basada en gotas. En la PCR digital de gotas (ddPCR), una muestra se divide en miles de gotas de tamaño nanolitro que contienen objetivos individuales que luego se cuantificarán utilizando las estadísticas de Poisson 2,3,4. Esta técnica le da a ddPCR una ventaja en la cuantificación de objetivos poco abundantes en comparación con las otras generaciones de PCR.
Recientemente, múltiples aplicaciones han puesto de relieve la superioridad de la ddPCR sobre la qPCR comúnmente utilizada al detectar y cuantificar objetivos de baja abundancia 1,5,6. El SARS-CoV-2 no es una excepción a estas aplicaciones 7,8,9,10,11,12. Desde el brote de SARS-CoV-2, los científicos han estado trabajando en todos los frentes para encontrar soluciones sobre cómo diagnosticar el virus y detectarlo de manera eficiente. El estándar de oro actual sigue siendo qPCR13. Sin embargo, se ha demostrado que la RT-ddPCR es más precisa en la detección de objetivos de SARS-CoV-2 de baja abundancia tanto en muestras ambientales como clínicas en comparación con RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. La mayoría de los trabajos publicados de ddPCR del SARS-CoV-2 dependen de ensayos simples, y los multiplexores dependen de ensayos comerciales. Por lo tanto, se debe hacer más para explicar cómo desarrollar ensayos RT-dPCR multiplex para la detección del SARS-CoV-2.
En un diseño de ensayo adecuado, la multiplexación se puede utilizar para ahorrar costos, aumentar el rendimiento de la muestra y maximizar el número de objetivos que se pueden detectar con sensibilidad dentro de una muestra pequeña. Al multiplexar con ddPCR, se debe tener en cuenta cuántos fluoróforos se pueden detectar en un sistema en particular. Algunas plataformas ddPCR pueden admitir hasta tres canales, mientras que otras solo admiten dos canales. Por lo tanto, cuando se multiplexa con dos canales, uno tiene que usar diferentes enfoques, incluida la multiplexación de orden superior para detectar más de dos objetivos14,15,16. En este trabajo, se utiliza un sistema de detección ddPCR de dos colores para mostrar los pasos sobre cómo desarrollar diferentes ensayos RT-ddPCR del SARS-CoV-2 que se pueden adaptar para diferentes aplicaciones de investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay pocos recursos disponibles sobre cómo desarrollar ensayos RT-ddPCR para la detección del SARS-CoV-2. Aunque no se utiliza en este artículo, las muestras estándar con copias conocidas se pueden utilizar para desarrollar y optimizar ensayos. Sin embargo, en este trabajo, las muestras de SARS-CoV-2 cultivadas en células Vero-E6 se enriquecieron en un fondo de ARN genómico humano y se utilizaron como muestras estándar para desarrollar los ensayos. Las secuencias adecuadas de cebadores y sondas son esenciales al de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por el Megaproyecto de Control de Enfermedades Infecciosas del Ministerio de Salud de China, número de subvención 2017ZX10302301-005 y el Centro de Investigación Conjunta Sino-África, número de subvención SAJC201605.
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
