SARS-CoV-2 검출 및 정량화를 위한 2단계 역전사 액적 디지털 PCR 프로토콜
Summary
이 작업은 2색 ddPCR 시스템을 사용하여 SARS-CoV-2 검출을 위한 다양한 분석법을 개발하는 단계를 요약합니다. 단계는 정교하며 분석 및 실험 성능을 개선하는 방법에 대한 메모가 포함되어 있습니다. 이러한 분석은 여러 SARS-CoV-2 RT-ddPCR 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
Abstract
진행중인 SARS-CoV-2 전염병의 진단은 전 세계 모든 국가의 우선 순위입니다. 현재 역전사 정량 PCR(RT-qPCR)은 영구적인 솔루션을 사용할 수 없기 때문에 SARS-CoV-2 진단의 황금 표준입니다. 이 기술이 아무리 효과적일 수 있지만, 특히 낮은 풍부 표적과 관련하여 탐지 및 진단의 한계를 보여주는 연구가 나타났습니다. 대조적으로, qPCR보다 우수한 장점을 가진 최근 신기술인 액적 디지털 PCR(ddPCR)은 낮은 풍부 표적 샘플에서 SARS-CoV-2 진단에서 RT-qPCR의 문제를 극복하는 것으로 나타났습니다. 이 기사에서는 2색 검출 시스템을 사용하여 심플렉스, 듀플렉스, 트리플렉스 프로브 믹스 및 쿼드러플렉스 분석을 개발하는 방법에 대한 단계를 보여줌으로써 RT-ddPCR의 기능을 더욱 확장합니다. SARS-CoV-2 게놈(N, ORF1ab, RPP30 및 RBD2)의 특정 부위를 표적으로 하는 프라이머와 프로브를 사용하여 이러한 분석법의 개발이 가능한 것으로 나타났습니다. 또한 분석 워크플로를 개선하고 데이터를 분석하는 방법에 대한 단계별 세부 프로토콜, 메모 및 제안이 제공됩니다. 향후 작업에서 이 워크플로우를 조정하면 작은 샘플에서 최대 수의 표적을 민감하게 검출할 수 있어 비용과 샘플 처리량이 크게 향상됩니다.
Introduction
잘 알려진 기술인 중합효소연쇄반응(PCR)은 핵산 연구에 대한 해답을 제공할 수 있는 강력한 기술이 되기 위해 등장한 이후 여러 가지 변형을 거쳤습니다. 이러한 변형은 이전 기술의 지속적인 개선이었습니다. 이러한 변형은 3세대로 요약할 수 있다1. 1세대는 증폭된 표적을 정량화하고 검출하기 위해 겔 전기영동에 의존하는 기존 PCR입니다. 2세대는 실시간으로 시료를 검출할 수 있는 정량적 실시간 PCR(qPCR)이며 표준 곡선을 사용하여 시료의 표적을 직접 정량화할 수 있습니다. 3세대 디지털 PCR(dPCR)은 표준 곡선 없이 핵산 표적의 검출 및 절대 정량을 모두 수행할 수 있습니다. dPCR은 또한 액적 기반 디지털 PCR2에서 볼 수 있는 것과 동일한 웰 내에서 벽의 웰에 의해 오일, 물 및 안정화 화학 물질의 에멀젼으로 분리되는 반응 챔버에서 더욱 개선되었습니다. 액적 디지털 PCR(ddPCR)에서 샘플은 나중에 푸아송 통계 2,3,4를 사용하여 정량화될 개별 표적을 포함하는 수천 나노리터 크기의 액적으로 분할됩니다. 이 기술은 ddPCR이 다른 세대의 PCR과 비교할 때 낮은 농도의 표적을 정량화하는 데 우위를 점할 수 있도록 합니다.
최근에, 다수의 응용은 낮은 풍부 표적 1,5,6을 검출하고 정량화할 때 일반적으로 사용되는 qPCR에 비해 ddPCR의 우월성을 강조했다. SARS-CoV-2도 이러한 응용 프로그램 7,8,9,10,11,12에서 예외는 아닙니다. SARS-CoV-2가 발생한 이후 과학자들은 바이러스를 진단하고 효율적으로 탐지하는 방법에 대한 솔루션을 제시하기 위해 모든 전선에서 노력해 왔습니다. 현재 금본위제는 여전히 qPCR13으로 남아 있습니다. 그러나 RT-ddPCR은 RT-qPCR 7,8,9,10,11,12와 비교할 때 환경 및 임상 모두에서 낮은 풍부 SARS-CoV-2 표적을 검출하는 데 더 정확한 것으로 나타났습니다. SARS-CoV-2 ddPCR 발표 작업의 대부분은 상업용 분석에 따라 다중 분석과 함께 심플렉스 분석에 의존합니다. 따라서 SARS-CoV-2 검출을 위한 다중 RT-dPCR 분석을 개발하는 방법을 설명하기 위해 더 많은 작업을 수행해야 합니다.
적절한 분석 설계에서 멀티플렉싱을 사용하여 비용을 절감하고 시료 처리량을 늘리며 작은 시료 내에서 민감하게 검출할 수 있는 표적 수를 최대화할 수 있습니다. ddPCR로 멀티플렉싱할 때 특정 시스템에서 얼마나 많은 형광단을 검출할 수 있는지 고려해야 합니다. 일부 ddPCR 플랫폼은 최대 3개의 채널을 지원할 수 있는 반면 다른 플랫폼은 2개의 채널만 지원할 수 있습니다. 그러므로, 2개의 채널로 다중화할 때, 2개 이상의 타겟(14,15,16)을 검출하기 위해 고차 다중화를 포함하는 상이한 접근법을 사용해야 한다. 이 작업에서는 2색 ddPCR 검출 시스템을 사용하여 다양한 연구 응용 분야에 적용할 수 있는 다양한 SARS-CoV-2 RT-ddPCR 분석을 개발하는 방법에 대한 단계를 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SARS-CoV-2 검출을 위한 RT-ddPCR 분석을 개발하는 방법에 대한 리소스는 거의 없습니다. 이 기사에서는 사용되지 않지만 알려진 사본이 있는 표준 샘플을 사용하여 분석을 개발하고 최적화할 수 있습니다. 그러나 이 작업에서는 Vero-E6 세포에서 성장한 SARS-CoV-2 샘플을 인간 게놈 RNA의 배경에 스파이크하여 분석을 개발하기 위한 표준 샘플로 사용했습니다. 적절한 프라이머 및 프로브 서열은 분석을 개?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 보건부의 전염병 통제 메가 프로젝트(보조금 번호 2017ZX10302301-005) 및 중국-아프리카 공동 연구 센터(보조금 번호 SAJC201605)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
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