Zweistufige digitale Transkriptions-Tröpfchenprotokolle für den Nachweis und die Quantifizierung von SARS-CoV-2
Summary
Diese Arbeit fasst Schritte zur Entwicklung verschiedener Assays für den SARS-CoV-2-Nachweis unter Verwendung eines zweifarbigen ddPCR-Systems zusammen. Die Schritte sind ausgeklügelt und es wurden Hinweise zur Verbesserung der Assays und der Versuchsleistung beigefügt. Diese Assays können für mehrere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-Anwendungen verwendet werden.
Abstract
Die Diagnose der anhaltenden SARS-CoV-2-Pandemie hat für alle Länder auf der ganzen Welt Priorität. Derzeit ist die quantitative PCR mit reverser Transkription (RT-qPCR) der Goldstandard für die Diagnose von SARS-CoV-2, da keine dauerhafte Lösung verfügbar ist. So effektiv diese Technik auch sein mag, es gibt Forschungsergebnisse, die ihre Grenzen bei der Erkennung und Diagnose aufzeigen, insbesondere wenn es um Ziele mit geringer Häufigkeit geht. Im Gegensatz dazu hat sich gezeigt, dass die Tröpfchen-Digital-PCR (ddPCR), eine neu aufstrebende Technologie mit überlegenen Vorteilen gegenüber der qPCR, die Herausforderungen der RT-qPCR bei der Diagnose von SARS-CoV-2 aus Zielproben mit geringer Abundanz überwindet. In diesem Artikel werden die Möglichkeiten der RT-ddPCR weiter ausgebaut, indem Schritte zur Entwicklung von Simplex-, Duplex-, Triplex-Sondenmischungs- und Quadruplex-Assays unter Verwendung eines Zweifarben-Detektionssystems gezeigt werden. Mit Hilfe von Primern und Sonden, die auf bestimmte Stellen des SARS-CoV-2-Genoms (N, ORF1ab, RPP30 und RBD2) abzielen, wird gezeigt, dass die Entwicklung dieser Assays möglich ist. Darüber hinaus werden Schritt für Schritt detaillierte Protokolle, Notizen und Vorschläge zur Verbesserung des Assay-Workflows und zur Analyse der Daten bereitgestellt. Durch die Anpassung dieses Arbeitsablaufs in zukünftigen Arbeiten wird sichergestellt, dass die maximale Anzahl von Targets in einer kleinen Probe empfindlich detektiert werden kann, was die Kosten und den Probendurchsatz erheblich verbessert.
Introduction
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), eine anerkannte Technik, hat seit ihrem Aufkommen mehrere Transformationen durchlaufen, um zu einer leistungsstarken Technik zu werden, die Antworten auf die Nukleinsäureforschung liefern kann. Diese Transformationen waren eine ständige Verbesserung der alten Technik. Diese Transformationen lassen sich in drei Generationenzusammenfassen 1. Die erste Generation ist die konventionelle PCR, die auf der Gelelektrophorese beruht, um amplifizierte Ziele zu quantifizieren und nachzuweisen. Die zweite Generation ist die quantitative Real-Time-PCR (qPCR), die Proben in Echtzeit nachweisen kann und sich auf eine Standardkurve stützt, um Ziele in einer Probe direkt zu quantifizieren. Die dritte Generation, die digitale PCR (dPCR), kann sowohl den Nachweis als auch die absolute Quantifizierung von Nukleinsäurezielen durchführen, ohne dass eine Standardkurve erforderlich ist. Die dPCR wurde auch weiter verbessert, da Reaktionskammern durch die Vertiefungen einer Wand in Emulsionen aus Öl, Wasser und stabilisierenden Chemikalien innerhalb derselben Vertiefung getrennt werden, wie dies bei der tröpfchenbasierten digitalen PCR2 der Fall ist. Bei der digitalen Tröpfchen-PCR (ddPCR) wird eine Probe in Tausende von nanolitergroßen Tröpfchen aufgeteilt, die einzelne Targets enthalten, die später mit Hilfe der Poisson-Statistik 2,3,4 quantifiziert werden. Diese Technik verschafft der ddPCR im Vergleich zu den anderen PCR-Generationen einen Vorteil bei der Quantifizierung von Zielmolekülen mit geringer Abundanz.
In jüngster Zeit haben mehrere Anwendungen die Überlegenheit der ddPCR gegenüber der häufig verwendeten qPCR bei der Detektion und Quantifizierung von Zielen mit geringer Abundanz hervorgehoben 1,5,6. SARS-CoV-2 ist keine Ausnahme von diesen Anwendungen 7,8,9,10,11,12. Seit dem Ausbruch von SARS-CoV-2 arbeiten Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler an allen Fronten an Lösungen, wie das Virus diagnostiziert und effizient nachgewiesen werden kann. Der aktuelle Goldstandard ist nach wie vor die qPCR13. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die RT-ddPCR im Vergleich zur RT-qPCR 7,8,9,10,11,12 genauer ist, wenn es darum geht, SARS-CoV-2-Ziele mit geringer Häufigkeit sowohl aus Umwelt- als auch aus klinischen Proben nachzuweisen. Die meisten der veröffentlichten SARS-CoV-2-ddPCR-Arbeiten hängen von Simplex-Assays ab, wobei die Multiplex-Assays von kommerziellen Assays abhängen. Daher sollte mehr getan werden, um zu erklären, wie Multiplex-RT-dPCR-Assays für den SARS-CoV-2-Nachweis entwickelt werden können.
In einem geeigneten Assay-Design kann Multiplexing verwendet werden, um Kosten zu sparen, den Probendurchsatz zu erhöhen und die Anzahl der Ziele zu maximieren, die innerhalb einer kleinen Probe empfindlich nachgewiesen werden können. Beim Multiplexing mit ddPCR muss berücksichtigt werden, wie viele Fluorophore in einem bestimmten System nachgewiesen werden können. Einige ddPCR-Plattformen können bis zu drei Kanäle unterstützen, während andere nur zwei Kanäle unterstützen. Daher muss man beim Multiplexing mit zwei Kanälen verschiedene Ansätze verwenden, einschließlich Multiplexing höherer Ordnung, um mehr als zwei Ziele zu erkennen14,15,16. In dieser Arbeit wird ein zweifarbiges ddPCR-Nachweissystem verwendet, um Schritte zur Entwicklung verschiedener SARS-CoV-2 RT-ddPCR-Assays zu zeigen, die für verschiedene Forschungsanwendungen angepasst werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt nur wenige Ressourcen zur Entwicklung von RT-ddPCR-Assays für den SARS-CoV-2-Nachweis. Obwohl in diesem Artikel nicht verwendet, können Standardproben mit bekannten Kopien zur Entwicklung und Optimierung von Assays verwendet werden. In dieser Arbeit wurden SARS-CoV-2-Proben, die in Vero-E6-Zellen gezüchtet wurden, jedoch in einen Hintergrund aus humaner genomischer RNA versetzt und als Standardproben für die Entwicklung der Assays verwendet. Die richtigen Primer- und Sondensequenzen sind bei der Entwicklung v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch das Megaprojekt zur Kontrolle von Infektionskrankheiten des chinesischen Gesundheitsministeriums, Fördernummer 2017ZX10302301-005, und das Sino-Africa Joint Research Center, Fördernummer SAJC201605, finanziert.
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
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