Visualisering af okulær morfogenese ved Lightsheet-mikroskopi ved hjælp af rx3: GFP Transgen zebrafisk

Summary

Her leveres en protokol til time-lapse-billeddannelse af okulær morfogenese ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt lysarkmikroskop og en billedbehandlingsarbejdsstation til analyse af de resulterende data. Denne protokol beskriver procedurerne for embryobedøvelse, indlejring i agarose med lav smeltetemperatur, suspension i billeddannelseskammeret, opsætning af billeddannelsesparametrene og endelig analyse af billeddata ved hjælp af billedanalysesoftware.

Abstract

Hvirveldyrs øjenudvikling er en kompleks proces, der begynder nær slutningen af embryogastrulation og kræver præcis koordinering af cellemigration, proliferation og differentiering. Time-lapse-forestilling giver unik indsigt i cellernes adfærd under øjenudvikling, fordi det giver os mulighed for at visualisere oculogenese in vivo. Zebrafisk er en fremragende model til at visualisere denne proces på grund af deres stærkt bevarede hvirveldyrs øje og deres evne til at udvikle sig hurtigt og eksternt, mens de forbliver optisk gennemsigtige. Time-lapse billeddannelsesundersøgelser af zebrafisk øjenudvikling lettes i høj grad ved brug af den transgene zebrafiskelinje Tg (rx3: GFP). I den udviklende forhjerne markerer rx3: GFP-ekspression cellerne i det enkelte øjenfelt, og GFP udtrykkes fortsat, når øjenfeltet evaginates for at danne en optisk vesikel, som derefter invaginaterer for at danne en optisk kop. Høj opløsning tidsforløb billeddannelse af rx3: GFP udtryk, giver os derfor mulighed for at spore øjet primordium gennem tiden, da det udvikler sig til nethinden. Lightsheet mikroskopi er en ideel metode til at afbilde okulær morfogenese over tid på grund af dets evne til at trænge ind i tykkere prøver til fluorescerende billeddannelse, minimere fotobleaching og fototoksicitet og billede med høj hastighed. Her leveres en protokol til time-lapse-billeddannelse af okulær morfogenese ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt lysarkmikroskop og en billedbehandlingsarbejdsstation til analyse af de resulterende data. Denne protokol beskriver procedurerne for embryobedøvelse, indlejring i agarose med lav smeltetemperatur, suspension i billeddannelseskammeret, opsætning af billeddannelsesparametrene og endelig analyse af billeddata ved hjælp af billedanalysesoftware. Det resulterende datasæt kan give værdifuld indsigt i processen med okulær morfogenese samt forstyrrelser i denne proces som følge af genetisk mutation, eksponering for farmakologiske midler eller andre eksperimentelle manipulationer.

Introduction

Embryonal udvikling er en kompleks proces, der kræver præcis koordinering af mange forskellige begivenheder. Dannelsen af hvirveldyrøjet begynder i den udviklende forhjerne, hvor en del af cellerne er specificeret som øjenfeltet. Disse celler vil evaginatere mod overfladen ektoderm, hvilket giver anledning til to bilaterale optiske vesikler 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Kontakt med overfladeektoderm inducerer derefter en invagination af den optiske vesikel i en optisk kop. Overfladeektodermen vil give anledning til øjets forreste strukturer, såsom linsen og hornhinden, mens den optiske kop vil give anledning til den neurale nethinde og retinal pigmenteret epitel 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Forstyrrelser i denne proces kan føre til medfødte defekter såsom mikroftalmi, anophthalmia og coloboma (MAC). På nuværende tidspunkt er der ingen muligheder for at rette op på disse fejl 3,5,6,7,9,10,11,12. Yderligere undersøgelser af mekanismerne for okulær morfogenese og de problemer, der kan føre til MAC, vil give et fundament af viden, der potentielt vil føre til behandlinger. Et kraftfuldt værktøj til at undersøge cellernes dynamiske adfærd under øjenudvikling er time-lapse-fantasi, som gør det muligt at visualisere og karakterisere denne proces in vivo og i realtid.

Zebrafisk (Danio rerio) er en fremragende model til at visualisere tidlig okulær udvikling ved hjælp af time-lapse-billeddannelse. De har et stærkt bevaret hvirveldyrøje og besidder evnen til at udvikle sig hurtigt og eksternt, mens de forbliver optisk gennemsigtige¹. Zebrafisk giver en stor ressource til time-lapse-billeddannelse på grund af disse egenskaber, som pattedyrsmodeller mangler. Time-lapse-billeddannelsesundersøgelser af zebrafiskens øjenudvikling lettes i høj grad ved hjælp af den transgene zebrafiskelinje Tg(rx3:GFP)¹³. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) er en transkriptionsfaktor, der er afgørende for øjenudvikling¹⁴. Rx3 er det første af de tre rx-gener i zebrafisken, der udtrykkes, startende med ekspressionen midt i gastrulationen, ca. 8 timer efter befrugtning (hpf)^15,16. rx3: GFP-transgenet kan visualiseres i den udviklende forhjerne, der starter ved 1 somitstadiet (ss), ca. 10 hkf 15,17,18,19,20. I den udviklende forhjerne markerer rx3: GFP-ekspression cellerne i det enkelte øjenfelt, og GFP (grønt fluorescerende protein) udtrykkes fortsat gennem resten af okulær morfogenese. Høj opløsning tidsforløb billeddannelse af rx3: GFP udtryk giver os derfor mulighed for at spore det enkelte øjenfelt gennem tiden, da det udvikler sig til nethinden 17,18,20.

Time-lapse billeddannelsesundersøgelser af zebrafiskens udvikling er primært blevet udført ved hjælp af konfokal eller Lightsheet mikroskopi. Konfokal mikroskopi er fordelagtig, fordi den giver mulighed for præcis billeddannelse af prøver langs z-aksen og reducerer fluorescerende baggrundssignal. Det er dog begrænset af den tid, det tager at erhverve et billede, prøvepositionsstivhed og dets tilbøjelighed til fotoblevask og fototoksicitet af levende prøver. Lightsheet mikroskopi er en ideel metode til at afbilde okulær morfogenese over tid på grund af dets evne til at trænge ind i tykkere prøver til fluorescerende billeddannelse, øget fleksibilitet i prøveorientering, minimeret fotobleaching og fototoksicitet og billeddannelse med høj hastighed 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ^,31. Den rumlige opløsning, der kan opnås med de nuværende lysarkmikrokopisystemer, er ca. 250-500 nanometer (nm). Selvom dette ikke er væsentligt forskelligt fra, hvad der kan opnås med konfokal mikroskopi, kan prøven frit roteres og afbildes fra flere vinkler, hvilket forbedrer både billeddybden og opløsningen og giver meget større fleksibilitet til in vivo time lapse-billeddannelseseksperimenter end den konfokale platform^27,32 . Af disse grunde er Lightsheet-mikroskopi hurtigt ved at blive den foretrukne metode til time-lapse-billeddannelsesundersøgelser af zebrafiskens udvikling. Denne protokol beskriver trinnene til kvantificering af oculogenese gennem billeddannelse af Rx3: GFP transgen zebrafisk ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt Lightsheet-mikroskop³³ og beskriver en pipeline til billedanalyse ved hjælp af arivis-softwareplatformen.

Protocol

Alle forsøg med anvendelse af zebrafisk blev udført i overensstemmelse med protokoller udarbejdet af University of Kentucky Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Prøveforberedelse Opsæt et parringspar Tg (Rx3: GFP) zebrafisk i en gated cross tank natten før billeddannelse er planlagt. Den følgende morgen trækker porten, da lysene tændes i fiskeanlægget 34,35.BEMÆRK: Det valgte parringspar skal være mellem 4 måneder og 2 år gammelt og er let at skelne mellem som mand eller kvinde baseret på kropsform og farve35. Kontroller krydsene hver halve time for embryoner og bemærk, hvornår embryoner først visualiseres i bunden af krydstanken. Overfør embryonerne til en petriskål, og hold embryonerne ved 28,5 °C i ca. 10 timer for at udvikle sig til 1-2 somitstadiet (ss). Begynd at afbilde på 1-2 somitstadiet (ss). For at screene for tilstedeværelsen af somitter skal du observere embryonerne under et stereoskop ved 10 hpf og tælle antallet af somitter1.BEMÆRK: Embryoner, der ligger uden for det enkelte somitstadium, bør ikke anvendes til dette forsøg. Ud af de embryoner, der befinder sig på det enkelte somitstadium, screenes for GFP-ekspression ved hjælp af en fluorescensadapter i kombination med et stereomikroskop for at bekræfte tilstedeværelsen af Rx3:GFP-transgenet. Når 3-5 GFP-positive individer er blevet identificeret, skal du bruge fine tang til at dekrinere embryonerne og overføre dem til en lille petriskål indeholdende E3-embryobuffer med en glaspipette35. Anæstesi embryonerne ved at overføre dem til 0,5 ml E3 embryobuffer (pH 7) indeholdende 0,168 mg/ml tricain (MS222) i et mikrocentrifugerør35,36. Spontane muskelbevægelser begynder allerede 17 hkf37. Sørg for, at embryoner er aæset til billede ud over dette tidspunkt. Integrer embryonerne i 1% agarose med lav smeltetemperatur i 0,168 mg/ml tricain og E3.BEMÆRK: Dette er den optimale koncentration af agarose med lav smeltetemperatur for at gøre det muligt at holde embryoet på plads, men forblive bøjelig nok til at tillade embryoets vækst i løbet af billeddannelsestiden30,31. Forbered en 10 ml opløsning af 2% agarose med lav smeltetemperatur i E3-buffer. Varm det op i en mikrobølgeovn for at opløse agarose med 15 s intervaller for at forhindre, at opløsningen koger over. Lad opløsningen afkøle nok til at holde uden ubehag, men ikke så meget, at den størkner og ikke forårsager skade på embryonerne. Når agarose er tilstrækkelig kølig, tilsættes 0,5 ml til embryonerne i røret af Tricain i E3 og pipetter forsigtigt opløsningen og embryonerne til blanding. Brug et 1 mm glaskapillær- og polytetrafluorethylenstempel (PTFE) stempel til at trække embryonerne i agaroseopløsningen op i kapillæren. Sørg for at trække i alt 3-5 embryoner (flere embryoner) ind i kapillæren for at øge sandsynligheden for at have et velpositioneret embryo.BEMÆRK: På grund af embryonernes runde natur på dette tidspunkt er det udfordrende at garantere en bestemt orientering i kapillæren. Ideelt set vil embryoets krop blive placeret sideværts i kapillæren, hvilket giver mulighed for den største lette positionering inden for mikroskopet. Lad agarose størkne over en periode på 30-60 s ved stuetemperatur. Kapillæren anbringes i et bægerglas på 0,168 mg/ml tricain i E3-bufferen, indtil den er klar til at blive afbildet (figur 1A).BEMÆRK: Den overskydende 2% agaroseopløsning med lav smeltetemperatur kan få lov til at størkne og efterfølgende genopvarmes i fremtidige forsøg. Kapillæren anbringes i prøveholderen (figur 1B-F) som beskrevet i trin 2.5. 2. Zeiss Lightsheet Z.1 opsætning Tænd for hver komponent i mikroskopet og computeren i følgende rækkefølge: 1) System, 2) PC, derefter 3) Inkubation (figur 2A). Placer 20x billeddannelsesmålet og 10x belysningsmålet i mikroskopkammeret. Match de objektive indstillinger i Zen Software-grænsefladen under fanen Vedligehold . Skub kammeret (figur 2C) ind i huset på sporet (figur 2B) med slangen vendt ud mod. Slangen tilsluttes de relevante porte til højre som vist i figur 2E. Fastgør forlængerledningen til sprøjten med luerlåsmekanismen (figur 2D); Fyld det med Tricain i E3 og læg det i holderen, der er fastgjort til højre for mikroskopet35. Tilslut forlængelsen, der er fastgjort til sprøjten fyldt med Tricain i E3 nederst til højre i kammeret med luerlåsmekanismen. Skub stemplet for at fylde kammeret med Tricaine/E3-bufferen. Luk døren til kammeret. Kapillæren med prøven anbringes i kapillærprøveholderen. Kapillærprøveholderen består af to gummimuffer, en metalprøveholderskive, en metalstamme og en metalhætte (figur 1B). Klik metalkappen ind i midten af metalskiven (figur 1C). Placer de to gummipropper i kappen, med slidserne vendt mod enderne af kappen efterfulgt af kapillæren. Skub kapillæren gennem midten af gummipropperne. Fastgør den på plads med metalhætten, når markøren er i bunden af metalkappen (figur 1D). Anbring kapillærprøveholderen på toppen af mikroskopet, hvor de hvide mærker justeres (figur 1E,F). Luk låget. Klik på knappen Find kapillær på softwaregrænsefladen (figur 3A). Brug ErgoDrive-kontrolpanelet, en manuel enhed, der styrer kapillærretningen (figur 3E), til at flytte kapillæren og placere den lige over målet (figur 3B). Åbn låget, og skub forsigtigt på stemplet, indtil den del af agarose, der indeholder embryoet, hænger under kapillærbunden og er foran målet (figur 3C). Sluk find kapillær , og klik på knappen Find prøve (figur 3A). Dette skifter visningen fra prøvekammerets webcam til mikroskopets mål (figur 3D). Brug denne visning til at justere prøvens placering mere præcist. Deaktiver Find eksempel (figur 3A). Skift over til fanen Anskaffelse . Markér afkrydsningsfelterne for Z-Stack og Time Series. I vinduet Parametre for anskaffelsestilstand skal du vælge indstillingen Dual Side Lightsheet og markere afkrydsningsfelterne for Online Dual Side Fusion og Pivot Scanning. I vinduet Kanaler skal du vælge 488 kanal, indstille lasereffekten til 1 og eksponeringstiden til 7,5 ms. Klik derefter på knappen Kontinuerlig for at få et live overblik over embryoet. Brug ErgoDrive-kontrolpanelet til at justere embryoets position, indtil øjenfeltet vender direkte mod kameraet. Fortsæt med at justere venstre og højre lysark i parametrene Kanaler, indtil øjenfeltet er tilstrækkeligt i fokus. Indstil Z-Stack-parametrene ved hjælp af ErgoDrive-kontrolpanelet til at bevæge sig gennem Z-planet. Indstil den første og den sidste Z-position omkring 500 μm ud over det sidste detekterbare fluorescerende signal. Dette giver plads til, at øjenfeltet forbliver i rammen, når embryoet vokser gennem hele time-lapse-billeddannelsessessionen. Når du har indstillet rækkevidden af Z-Stack, skal du klikke på knappen Optimal for at indstille trinstørrelsen til 0,477 μm, den optimale indstilling. Indstil inkubationsparametrene ved at markere afkrydsningsfeltet for Peltier-enheden for at holde temperaturen på 28 °C. I vinduet Tidsserie skal du vælge frekvens og tidsinterval for at hente billeder. I denne protokol blev parametrene indstillet til billede hvert 5. minut i alt 166 intervaller. Klik på knappen Start eksperiment . Vælg mappen for at gemme billedsættet. Indstil billedpræfikset, og tryk på Gem for at starte billeddannelsen.BEMÆRK: Mikroskopet vil nu køre gennem hvert billedsæt med det angivne interval. Når timelapse-billedbehandlingen er afsluttet, skal du sende fasen til belastningspositionen og fjerne kapillærprøveholderen. Tag kapillærprøveholderen fra hinanden i omvendt rækkefølge, som den blev sat sammen, og brug stemplet til at fjerne prøven og overskydende agarose fra kapillæren. Åbn kammerdøren. Brug sprøjten til at fjerne kammervæsken fra kammeret, frakobl og fjern kammeret, skyll derefter med vand og lufttør. 3. Billedanalyse Åbn arivis Vision4D-softwareprogrammet. Klik på Filer, og vælg derefter Importer fil. Vælg alle .czi-filer fra timelapse-billedbehandlingssessionen, og åbn. Det næste vindue åbnes med indstillingerne for, hvordan du importerer filerne; vælg Z-stacks som Frames for at bestille z-stacks i den opnåede rækkefølge. Når filerne er blevet importeret, gemmer softwaren som en enkelt .sis-fil. For at angive placeringen for den fil, der skal gemmes, skal du vælge mappen, før du klikker på Importer. Når filen er importeret, er arivis nu klar til at gengive en video af timelapse-billederne. Klik på 4D Viewer Cube i nederste venstre hjørne og ikonet Skalabjælke (figur 4D-E). Klik på videoikonet for at bringe Storyboard-proceslinjen til bunden af skærmen (figur 4C). På storyboardets proceslinje skal du vælge Tilføj Keyframe-sekvens (figur 4F). Angiv videoens varighed i sekunder, fjern markeringen i afkrydsningsfeltet Opret rotation , og marker afkrydsningsfeltet Brug tidsprogression for at inkludere de specifikke tidspunkter i videoen. Softwaren viser disse parametre til højre for Storyboard proceslinjen for eventuelle justeringer til enhver tid. Gem Storyboardet for at anvende de samme parametre på flere billedsæt (figur 4F). Klik på Eksporter film for at gemme en video af time-lapse-billeddannelsen (figur 4F). Angiv indstillingerne for filmeksport, herunder filnavn og placering, videoformat (.mp4), videoopløsning (1.080 p), billedhastighed (60 FPS) og dataopløsning (1.297 x 1.297 x 784). Tilføj tidsstempler her, hvis det ønskes. Når disse parametre er indstillet, skal du vælge Optag (figur 4F). Trin 3.4 og 3.5 kan gentages med ændring til trin 3.4 for at oprette rotationsvideoer på bestemte tidspunkter. Når du føjer en keyframe-sekvens til storyboardet, skal du markere afkrydsningsfeltet Opret rotation og fjerne markeringen i Brug tidsprogression. Følg derefter de samme instruktioner som i trin 3.5. Hvis du vil gengive et billede i høj opløsning i en hvilken som helst retning på et hvilket som helst tidspunkt, skal du vælge ikonet Kamera i 4D-fremviseren for at få et billede i høj opløsning (figur 4C). Hvis du vil oprette en pipeline til analyse, skal du vælge ikonet Kolbe for at få adgang til panelet Analyse (figur 4B). Klik på rullemenuen Analysehandlinger i panelet Analyse. Som et eksempel demonstrerer protokollen nedenfor rækkefølgen af operationer for en volumenanalyserørledning. Kør eller fortryd hvert trin i pipelinen individuelt for at finjustere hver parameter (tabel 1). Klik på den blå trekant øverst i pipelinen for at lade pipelinen køre.BEMÆRK: Dette vil tage lidt tid afhængigt af computerens hastighed. Når pipelinen er optimeret, kan pipelinen nemt eksporteres og importeres til arivis og anvendes på flere datasæt i en batchanalyse. For at få adgang til batchanalyse skal du klikke på Batchanalyse under fanen Analyse . Når rørledningen kører, trækker et vindue op med alle de fundne objekter. Få adgang til dette manuelt via ikonet Tabel (figur 4B). Øverst i dette vindue skal du klikke på feltet mærket Funktionskolonner for at hente en liste over funktioner, der kan give oplysninger om objektet af interesse. Til analyse af øjenfeltvolumen omfatter disse funktioner Overfladeareal, Volumen (Volumen, VoxelCount), Intensiteter #1 (Middelværdi), Attributter (Id, Type) og Tidspunkt (Første). Klik på Eksporter for at eksportere dataene til et regneark.

Representative Results

Datasættet, der vises her, blev afbildet ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor. Et Tg(Rx3:GFP) embryo blev afbildet fra 1 somitstadiet (ss) til 24 hpf, en samlet tidsperiode på 14 timer, med billederne erhvervet med 5 minutters intervaller. Time-lapse-billeddannelse giver mulighed for let valg og sammenligning af ethvert tidspunkt, der viser en fænotype af interesse. Figur 5 viser et sæt billeder i høj opløsning, der blev gengivet fra det dorsale udsigtspunkt på udvalgte udviklingstidspunkter. Rørledningen, der løber i arivis Vision4D, bygger en maske, der repræsenterer det udviklende øje som identificeret ved fluorescerende signal. I figur 5 og videoer 1-6 kan masken visualiseres i forhold til den fluorescerende gengivelse af det udviklende øje. Derudover viser tabel 2 volumendataene fra det udviklende øje på hvert billeddannelsespunkt. Dette datasæt indeholder segmentnavnet, id, volumen i både μm3 og voxelantal, objektets gennemsnitlige fluorescensintensitet, det tidspunkt, hvor objektet blev identificeret, og objektets overfladeareal i μm2. Det er vigtigt at bemærke, at når øjenfeltet adskilles i to optiske vesikler (startende ved tidspunkt 64), forbliver der en tredje region, der er Rx3: GFP positiv i forhjernen, hvilket vil bidrage til hypothalamus 38,39,40 (figur 5D-M). Dette fremgår af de volumendata, der er repræsenteret i tabel 2 (fremhævet med gult startende ved timepunkt 71) og kan let adskilles fra de optiske vesikler, da det er meget mindre i volumen end begge optiske vesikler. Figur 1: Prøveforberedelse. (A) Placering af embryoner i en glaskapillær. Pilen peger på et embryo i kapillæren. B) Dele til kapillær- og kapillærholdere af glas. C) Delvis samlet kapillærholder. D) Fuldt samlet kapillærholder. (E) Monteringskammer til lysark. Pilen angav den hvide linje, der blev brugt til at orientere kapillærholderen. (F) Kapillærholder korrekt monteret i lysarket. Pilen viser de matchende hvide linjer, der angiver korrekt orientering af kapillærholderen. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 2: Opsætning af lightsheet-billedbehandling. (A) Tavle til at tænde Lightsheet, computer og inkubationsenhed. Tallene angiver rækkefølgen af operationer. (B) Lightsheet objektivt kammer. (C) Billedkammer. (D) Sprøjte og slange, der vil blive forbundet til billedkammeret. (E) Billedkammeret er korrekt placeret i det objektive kammer med alle rørene forbundet til de relevante porte til højre. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 3: Prøvepositionering. (A) Find kapillær – og lokaliseringsknapperne i Zen-softwaren som angivet med pilene. B) Anbringelsen på glaskapillæren. Pilen angiver kanten af glaskapillæren placeret lige over objektivets linse. C) Embryosuspensionen ud over glaskapillæren. Pilen angav embryoet ophængt i agarose under glaskapillæren foran målets linse. D) Visning af embryoet gennem målet. (E) ErgoDrive-kontrolpanelet. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 4: Vigtige ikoner til navigering i arivis Vison4D. Hvert panel har ikonfunktionen identificeret fra venstre mod højre. (A) Åbn, Gem, Luk. (B) Analysepanel, Vis objekttabel, Åbn sporeditor. (C) Kopier det aktuelle seerindhold som et billede til udklipsholderen, Skift bogmærker, Opret et billede i høj opløsning til den aktuelle visning, Skift storyboard. (D) Vis målefelt, Vis retningskryds, Vis forklaring, Vis skalalinje. (E) Vis som 2D-fremviser, Vis som gallerifremviser, Vis som 4D-fremviser, Vis som infofremviser, Vis som projektionsfremviser. F) Opdater alle Keyframes, Tilføj Keyframe, Tilføj Keyframe-sekvens, Indsæt Keyframe, Fjern alle Keyframes, Eksporter film, Indlæs Storyboard, Gem Storyboard, Juster måltiden for hele filmen, First Keyframe, Play, Pause, Stop, Last Keyframe. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 5: Billeder i høj opløsning og øjenfeltmasker. (A-M) Et sæt billeder i høj opløsning, der blev gengivet fra de dorsale udsigtspunkter; (A’-M’) øjenfeltmaskerne for hvert tilsvarende tidspunkt. Hvert billedsæt noteres på det tidspunkt, hvor det blev erhvervet fra starten af billeddannelsen og det tilsvarende udviklingsstadium i enten somitstadiet (ss) eller timer efter befrugtning (hpf). Klik her for at se en større version af denne figur. Video 1: Time-lapse video af Tg(rx3:GFP) zebrafisk embryo fra 1 ss-24 hpf. Højreklik her for at downloade videoen (gem link som). Video 2: Time-lapse-video af Tg(rx3:GFP) zebrafiskembryo fra 1 ss-24 hpf med øjefeltet som identificeret af arivis Vision4D-rørledningen. Højreklik her for at downloade videoen (gem link som).  Video 3: 360° rotation af et Tg(rx3:GFP) zebrafiskembryo ved 1 ss. Højreklik her for at downloade videoen (gem link som).  Video 4: 360° rotation af en Tg(rx3:GFP) zebrafisk embryo øjenfeltmaske ved 1 ss. Højreklik her for at downloade videoen (gem link som).  Video 5: 360° rotation af et Tg(rx3:GFP) zebrafiskembryo ved 24 hkf. Højreklik her for at downloade videoen (gem link som).  Video 6: 360° rotation af en Tg(rx3:GFP) zebrafisk embryo øjenfeltmaske ved 24 hkf. Højreklik her for at downloade videoen (gem link som).  Tabel 1: arivis Vision4D-pipeline til volumenanalyse af det udviklende øjenfelt. Klik her for at downloade denne tabel. Tabel 2: Volumen og overfladeareal af det udviklende øjenfelt erhvervet af arivis Vision4D. Rækkerne vedrørende den formodede hypothalamus er fremhævet med gult for at skelne dem fra de optiske vesikler. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

I denne protokol blev Lightsheet-mikroskopet brugt til at udføre time-lapse-billeddannelse af øjenudvikling, og de resulterende data blev analyseret. Det resulterende datasæt kan give værdifuld indsigt i processen med okulær morfogenese samt forstyrrelser i denne proces som følge af genetisk mutation, eksponering for farmakologiske midler eller andre eksperimentelle parametre. Her demonstrerede protokollen, hvordan dette datasæt kan opnås og gav et eksempel på, hvordan man analyserer øjenfeltets volumen gennem tidlig udvikling. Disse data viste sig at være reproducerbare og konsistente (mindre end 10% variation i volumen) på tværs af biologiske replikater, idet man husker på, at små forskelle i embryoiscenesættelse inden starten af løbet kan føre til en vis variation i endelige volumenmålinger.

Der skal tages hensyn til den indledende positionering af embryoet i kapillæren og ved placering af det indlejrede embryo foran målet. Orientering spiller en vigtig rolle i at forhindre embryoet i at vokse og bevæge sig ud af målets syn. Embryonerne har en rund form ved 10 hkf, hvilket gør det udfordrende at garantere en bestemt orientering i kapillæren. Ideelt set vil embryoets krop blive placeret sideværts i kapillæren. Indlæsning af flere embryoner i kapillæren vil øge sandsynligheden for at have et velpositioneret embryo.

I denne procedure er embryoet indlejret i agarose for at suspendere det foran billeddannelses- og belysningsmålene. At vælge den korrekte koncentration af agarose med lav smeltetemperatur er kritisk. For høj koncentration vil indsnævre embryoet og forhindre det i at udvikle sig korrekt; for lav koncentration vil resultere i, at agarose falder fra hinanden og ikke holder embryoet. Den koncentration, der er optimal for denne protokol^, er en endelig koncentration på 1% lav smeltetemperatur agarose^30,31.

Et andet element, der skal tages i betragtning, er mætningsniveauet. Efterhånden som øjenfeltet vokser og differentieres, intensiveres styrken af Rx3: GFP-signalet. Derfor, når du indstiller de indledende billeddannelsesparametre, skal eksponeringen og lasereffekten reduceres for at undermætte billedet. Dette forhindrer billedet i at blive overmættet, da Rx3: GFP bliver lysere over tid. Der kan foretages ændringer for at korrigere for undermætning i billedbehandling, men overmætning kan ikke korrigeres, efter at billederne er erhvervet.

Der er et par yderligere ændringer, der kan foretages i denne protokol, som kan være fordelagtige for nogle projekter, der ikke er beskrevet i dette papir. Det er f.eks. muligt at konfigurere Multiview-billeddannelse i opsætningen af billedoptagelse. Denne parameter ville gøre det muligt at afbilde flere embryoner på forskellige positioner langs y-aksen sekventielt ved hvert tidsinterval. Samtidig med at det tilføjer kompleksitet til datasættet, vil det øge dataindsamlingshastigheden. Derudover er det med hensyn til billedbehandling muligt at kvantificere øjenfeltet ved hjælp af andre parametre. Her beskrev vi, hvordan man kvantificerer dataene med hensyn til øjenfeltvolumen. Alternativt kan der laves en rørledning til at kvantificere og spore individuelle celler eller bestemme hastigheden af optisk vesikleforherligelse.

Som tidligere nævnt er både konfokal og Lightsheet mikroskopi blevet brugt til at udføre time-lapse billeddannelsesundersøgelser af zebrafisk. Lightsheet blev specielt udvalgt til dette projekt på grund af dets overlegne evne til at afbilde gennem en tyk (>1 mm) prøve, fordi det er udstyret med en inkubationsenhed for at opretholde et ideelt temperaturmiljø for zebrafiskembryoet, og fordi dets evne til at afbilde hurtigere end konfokal mikroskopi muliggør billedoptagelse med de mange tidsintervaller, der kræves til denne protokol, ingen ledsagende skade eller fotoblegning af embryoet^21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Det er også vigtigt at bemærke, at Lightsheet-mikroskopet er udstyret til at afbilde signalet fra flere fluoroforer. Lightsheet-mikroskopet, der anvendes i denne undersøgelse, har solid state laser excitationslinjer ved 405, 445, 488, 515, 561 og 638 nm, hvilket kan være nyttigt til billeddannelse af transgene embryoner, der udtrykker mere end et fluorescerende reportertransgen.

Mens denne protokol beskriver instruktioner til billedoptagelsesanalyse specifikt ved hjælp af Lightsheet Z.1 Dual Illumination Microscope System og arivis Vision4D-analysesoftware, er der andre kommercielt tilgængelige Lightsheet-mikroskoper fremstillet af Leica, Olympus og Luxendo samt billedanalysesoftware fra Imaris, der kan bruges til at opnå lignende resultater. Udvælgelsen af udstyr og software til denne protokol blev bestemt af tilgængeligheden på vores institution.

Sammenfattende forventes det, at denne protokol vil give et solidt udgangspunkt for at udføre time-lapse-billeddannelse ved hjælp af Lightsheet-mikroskopi og for billedkvantificering af tidlig øjenudvikling hos zebrafisk.

Materials

60mL Syringe Luer-Lok Tip	BD	309653
Agarose, Low Melting Temperature	Promega	V2111
arivis Vision4D Software	arivis	https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d
Dumoxel N3C Forceps	Dumont	0203-N3C-PO
E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)
Glass Capillary – Size 2 (~1mm)	Zeiss	Black/701904
Heidelberger Extension Line 100cm	B. Braun	4097262
Light & Filter Set – Royal Blue	Night Sea	SFA-LFS-RB
Petri Dish (100 x 15 mm)	VWR	25384-302
Stereomicroscope Fluorescence Adapter	NightSea
Teflon Tipped Plunger – Size 2	Zeiss	#701997
Tg(rx3:GFP) zebrafish		This line was established by Rembold et al.13
Tricaine (MS222)	Sigma	A-5040
Z.1 Lightsheet	Zeiss
Zen Software	Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html