Inducción dirigida de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes humanas
Summary
Utilizando un método de autoorganización, desarrollamos un protocolo con la adición de COCO que podría aumentar significativamente la generación de fotorreceptores.
Abstract
El trasplante de células de la retina es un enfoque terapéutico prometedor, que podría restaurar la arquitectura de la retina y estabilizar o incluso mejorar las capacidades visuales de la retina degenerada. Sin embargo, el progreso en la terapia de reemplazo celular actualmente enfrenta los desafíos de requerir una fuente estándar de retinas humanas estandarizadas y de alta calidad. Por lo tanto, se necesita un protocolo fácil y estable para los experimentos. Aquí, desarrollamos un protocolo optimizado, basado en un método de autoorganización con el uso de moléculas exógenas y reactivo A, así como la escisión manual para generar los organoides tridimensionales de la retina humana (RO). La RO derivada de células madre pluripotentes humanas (PSC) expresa marcadores específicos para los fotorreceptores. Con la adición de COCO, un antagonista multifuncional, la eficiencia de diferenciación de los precursores y conos de fotorreceptores aumenta significativamente. El uso eficiente de este sistema, que tiene los beneficios de las líneas celulares y las células primarias, y sin los problemas de abastecimiento asociados con estas últimas, podría producir células retinianas confluentes, especialmente fotorreceptores. Por lo tanto, la diferenciación de PSC a RO proporciona una plataforma óptima y biorelevante para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y el trasplante celular.
Introduction
Las células madre pluripotentes (PSC) se caracterizan por su auto-renovación y capacidad para diferenciarse en todo tipo de células somáticas. Por lo tanto, los organoides derivados de PSC se han convertido en un recurso importante en la investigación de la medicina regenerativa. La degeneración retiniana se caracteriza por la pérdida de fotorreceptores (bastones y conos) y epitelio pigmentario de la retina. El reemplazo de células retinianas podría ser un tratamiento alentador para esta enfermedad. Sin embargo, no es factible obtener retinas humanas para la investigación y terapia de enfermedades. Por lo tanto, los organoides retinianos (RO) derivados de PSCs, que recapitulan de manera efectiva y exitosa las células retinianas nativas de múltiples capas, son beneficiosos para la investigación básica y traslacional 1,2,3. Nuestra investigación se centra en la diferenciación de RO para proporcionar células suficientes y de calidad para estudiar la degeneración retiniana4.
Los métodos para diferenciar las RO están surgiendo continuamente, con la diferenciación de suspensión tridimensional (3D) iniciada por el laboratorio Sasai en 20125. Introdujimos la etiqueta CRX-tdTomato en las células madre embrionarias humanas (hESCs) para rastrear específicamente las células precursoras de fotorreceptores y modificamos el método con la adición de COCO, un antagonista multifuncional de las vías Wnt, TGF-β y BMP6. Se ha demostrado que el COCO mejora eficientemente la eficiencia de diferenciación de los precursores y conos de los fotorreceptores 6,7.
En conjunto, al modificar el método clásico de diferenciación, hemos desarrollado un protocolo accesible para recolectar abundantes precursores y conos de fotorreceptores de RO humanos para analizar la enfermedad retiniana asociada con los fotorreceptores a través de investigaciones de laboratorio y para su posterior aplicación clínica / trasplante.
Protocol
Representative Results
Discussion
La diferenciación de organoides retinianos es un método deseable para la generación de amplias células funcionales de la retina. La RO es un compuesto de diferentes células de la retina, como células ganglionares, células bipolares y fotorreceptores, generados por células madre pluripotentes hacia la retina neural 4,5,8,9. Aunque se pueden cosechar RO confluentes, lleva mucho tiempo, lo…
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio 502 por sus apoyos técnicos y comentarios útiles sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Municipal de Ciencias Naturales de Beijing (Z200014) y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
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