Оценка функциональных показателей здоровья скелетных мышц в микротизносах скелетных мышц человека
Summary
В этой рукописи описывается подробный протокол для получения массивов 3D-микротизов скелетных мышц человека и минимально инвазивных анализов функции in situ, включая анализы сократительной силы и обработки кальция.
Abstract
Трехмерные (3D) in vitro модели скелетных мышц являются ценным прогрессом в биомедицинских исследованиях, поскольку они дают возможность изучать реформацию и функционирование скелетных мышц в масштабируемом формате, который поддается экспериментальным манипуляциям. 3D-системы мышечных культур желательны, поскольку они позволяют ученым изучать скелетные мышцы ex vivo в контексте клеток человека. 3D-модели in vitro близко имитируют аспекты структуры нативной ткани скелетных мышц взрослого человека. Однако их универсальное применение ограничено наличием платформ, которые просты в изготовлении, дороги и удобны для пользователя, а также дают относительно большое количество скелетных мышечных тканей человека. Кроме того, поскольку скелетные мышцы играют важную функциональную роль, которая нарушается с течением времени во многих болезненных состояниях, экспериментальная платформа для исследований микротизвестности наиболее практична, когда минимально инвазивные измерения преходящих и сократительных сил кальция могут проводиться непосредственно внутри самой платформы. В этом протоколе описывается изготовление 96-хорошей платформы, известной как «MyoTACTIC», и массовое производство 3D-микротизов скелетных мышц человека (hMMT). Кроме того, представлены методы минимально инвазивного применения электрической стимуляции, которая позволяет повторно измерять силу скелетных мышц и обработку кальция каждого микротизнеса с течением времени.
Introduction
Скелетные мышцы являются одной из самых распространенных тканей в организме человека и поддерживают ключевые функции организма, такие как передвижение, тепловой гомеостаз и метаболизм1. Исторически сложилось так, что животные модели и двумерные (2D) системы клеточных культур использовались для изучения биологических процессов и патогенеза заболеваний, а также для тестирования фармакологических соединений при лечении заболеваний скелетных мышц2,3. В то время как животные модели значительно улучшили наши знания о скелетных мышцах в области здоровья и болезней, их трансляционное воздействие было затруднено высокими затратами, этическими соображениями и межвидовыми различиями2,4. Обращаясь к клеточным системам человека для изучения скелетных мышц, 2D-системы клеточных культур благоприятны из-за их простоты. Однако есть ограничение. Этот формат часто не может повторить взаимодействия клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс, которые происходят естественным образом в организме5,6. За последние несколько лет трехмерные (3D) модели скелетных мышц стали мощной альтернативой целым животным моделям и обычным системам 2D-культур, позволяя моделировать физиологически и патологически значимые процессы ex vivo7,8. Действительно, множество исследований сообщили о стратегиях моделирования скелетных мышц человека в биоискусственном формате 3D-культуры1. Одним из ограничений для многих из этих исследований является то, что активная сила количественно определяется после удаления мышечных тканей из платформ культуры и прикрепления к преобразователю силы, который является разрушительным и, следовательно, ограничен в качестве анализа конечнойточки 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. ,19,20,21. Другие разработали системы культивирования, которые позволяют использовать неинвазивные методы измерения активной силы, но не все поддаются тестированию молекул с высоким содержанием приложений7,8,9,10, 14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Этот протокол описывает подробный метод изготовления микротюсов мышц человека (hMMT) в платформе скелетных мышц (Myo) microTissue Array deviCe To Explore forCe (MyoTACTIC); пластинчатое устройство на 96 скважин, которое поддерживает массовое производство 3D микротиз30скелетных мышц. Метод изготовления пластин MyoTACTIC позволяет генерировать 96-луночную полидиметилсилоксановую (PDMS) культуральную пластину и все соответствующие характеристики скважины на одной стадии литья, в соответствии с которой для каждой скважины требуется относительно небольшое количество клеток для формирования микротизвестков. Микроткани, образующиеся в пределах MyoTACTIC, содержат выровненные, поперечно-полосатые и многоядерные миотрубки, которые воспроизводятся от колодца к колодцу устройства и при созревании могут реагировать на химические и электрические раздражители in situ30. В настоящем описаны и обсуждены методика изготовления пластинчатого устройства PDMS MyoTACTIC из полиуретановой (PU) реплики, оптимизированный метод реализации увековеченных миогенных клеток-предшественников человека для изготовления hMMT, а также функциональная оценка инженерной генерации силы hMMT и свойств обработки кальция.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи описываются методы изготовления и анализа модели культуры 3D hMMT, которая может быть применена к исследованиям базовой мышечной биологии, моделированию заболеваний или для тестирования молекул-кандидатов. Платформа MyoTACTIC является экономичной, простой в изготовлении и т?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Мохаммада Афшара, Хабена Абраху, Мохсена Афшар-Бакушли и Садега Давуди за вклад в изобретение платформы культуры MyoTACTIC и создание методов изготовления и анализа, описанных в настоящем документе. HL получила финансирование от Учебной программы Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) в области инженерии и предпринимательства Organ-on-a-Chip и стипендий для выпускников Университета Торонто Wildcat. PMG является Канадской исследовательской кафедрой эндогенного восстановления и получила поддержку для этого исследования от Института регенеративной медицины Онтарио, Сети стволовых клеток и от Medicine by Design, Канадской программы первого научного совершенства. Принципиальные схемы создавались с помощью BioRender.com.
Materials
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma – Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma – Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma – Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma – Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 – 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma – Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope – Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma – Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma – Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma – Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at – 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
- Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
- DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
- Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
- Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
- Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
- Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
- Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
- Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
- Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
- Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
