髄膜炎性大腸菌に感染した好中球における活性酸素種のリアルタイム定量
Summary
大腸菌 は、新生児グラム陰性細菌性髄膜炎の主な原因である。細菌感染の間、好中球によって産生される活性酸素種は主要な殺菌的役割を果たす。ここでは、大 腸菌の髄膜炎に応答して好中球中の活性酸素種を検出する方法を紹介する。
Abstract
大腸菌 (大腸菌)は、新生児髄膜炎を引き起こす最も一般的なグラム陰性細菌である。血液脳関門を通る菌血症の発生と細菌の浸透は、 大腸菌 髄膜炎の発症に不可欠なステップである。活性酸素種(ROS)は、侵入した病原体を破壊する好中球の主要な殺菌機構を表す。このプロトコルでは、髄血性 大腸菌 に感染した好中球における時間依存性細胞内ROS産生を、リアルタイム蛍光マイクロプレートリーダーによって検出された蛍光ROSプローブを用いて定量した。この方法は、病原体と宿主の相互作用の間の哺乳動物細胞におけるROS産生の評価にも適用され得る。
Introduction
新生児細菌性髄膜炎は一般的な小児感染症である。K1カプセルを有する大腸菌(大腸菌)は、新生児細菌性髄膜炎を引き起こす最も一般的なグラム陰性病原体であり、全発生率1、2、3の約80%を占める。抗菌化学療法と支持ケアの進歩にもかかわらず、細菌性髄膜炎は依然として罹患率と死亡率が高い最も壊滅的な状態の1つである4.
新生児細菌性髄膜炎の発生は、通常、新生児の局所病変から末梢循環への病原性細菌の侵入によって引き起こされる細菌血症から始まり、続いて血液脳関門(BBB)を通して脳に浸透し、髄膜4の炎症をもたらす。菌血症の発症は、好中球やマクロファージ等を含む細菌と宿主免疫細胞との相互作用に依存する。白血球の50~70%を占める好中球は、細菌感染に対する防御の第1線である5,6である。細菌の侵入の間、活性化された好中球は、感染部位にリクルートされ、超酸化物アニオン、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、および一重酸素7を含む活性酸素種(ROS)を放出する。ROSは、細胞膜、核酸分子および細菌のタンパク質との酸化還元反応を受け、侵入菌8の傷害および死をもたらす。ミトコンドリアは、真核細胞におけるROS産生の主な部位であり、各種オキシダーゼ(例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)オキシダーゼ複合体、リポキシゲナーゼ系、プロテインキナーゼCおよびシクロオキシゲナーゼ系)の産生を仲介する。好中球における主要な抗菌機構を表すROSの生産のリアルタイム測定は、細菌と宿主の相互作用の間に宿主防御を研究するための有用な方法である。
このプロトコルでは、髄空大腸菌 に感染した好中球における時間依存的ROS産生を、蛍光ROSプローブDHEで定量し、リアルタイム蛍光マイクロプレートリーダーによって検出した。この方法は、病原体と宿主の相互作用の間に他の哺乳動物細胞におけるROS産生の評価にも適用され得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
好中球は、ヒト血液循環における白血球の最も豊富な成分として機能する。それらは、病原体11の侵入に対する防御の第一線を構築する先天的なヒト免疫系における重要なエフェクター細胞である。ROSの生成は、食作用11に続く好中球の主要な殺菌機構の1つを表す。最近の研究では、好中球細胞外トラップ(NET)と呼ばれる好中球によって放出されるネット状…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団(31670845、31870832、32000811)と遼寧省特別教授プログラム(LJH2018-35)によって支援されました。
Materials
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments. Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S. Human Meningitis-Associated Escherichia coli. EcoSal Plus. 7 (1), (2016).
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J. neutrophil function test. Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
