本报告描述了从生物样品中分离和纯化硫酸化糖胺聚糖（GAGs）的技术，以及通过聚丙烯酰胺凝胶电泳估算其分子大小的方法。GAGs 通过与蛋白质的静电相互作用参与组织结构的构建，并影响信号传导过程。GAG 聚合物的长度影响其与相应配体的结合亲和力。
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本文内容
摘要
摘要
硫酸化糖胺聚糖（GAGs），如硫酸乙酰肝素（HS）和硫酸软骨素（CS），广泛存在于生物体中，在多种基本的生物结构和生理过程中发挥着关键作用。作为多聚物，GAGs 以多分散性混合物的形式存在，包含的多糖链分子量范围从 4000 Da 到超过 40,000 Da 不等。这些多糖链中含有硫酸化结构域，形成负电荷分布模式，从而促进其与相应蛋白配体中的正电荷残基相互作用。GAGs 的硫酸化结构域必须达到足够的长度，才能实现此类静电相互作用。为了理解 GAGs 在生物组织中的功能，研究人员必须能够分离、纯化并测定 GAGs 的大小。本报告介绍了一种实用且通用的基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术，可用于分辨从多种生物组织类型中分离得到的 GAGs 在大小上的相对微小差异。
引言
糖胺聚糖（GAGs）是 一类普遍存在于生物体内的线性多糖家族，参与多种基本生理过程1糖胺聚糖（GAGs）如硫酸乙酰肝素（heparan sulfate, HS）和硫酸软骨素（chondroitin sulfate, CS）可在多糖链的不同位置发生硫酸化修饰，形成具有负电荷的区域结构域。当这些GAGs共价连接于细胞表面被称为蛋白聚糖的蛋白质时，会延伸至细胞外空间，并与相应的配体结合，从而调控顺式（配体位于同一细胞上）和反式（配体位于邻近细胞上）信号传导过程。2此外，糖胺聚糖（GAGs）还在组织中作为结构成分发挥关键作用，例如肾小球基底膜3，血管内皮糖萼4 肺上皮糖萼5，以及软骨等结缔组织中6.
糖胺聚糖（GAG）多糖链的长度因其生物学背景不同而存在显著差异，并可通过一个高度复杂的酶调控系统进行动态延长、切割和修饰7。重要的是，GAG聚合物链的长度显著影响其与配体的结合亲和力，进而影响其生物学功能8,9。因此，要确定内源性G....
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方案
本方案中分析的所有生物样本均来自小鼠，实验方案经科罗拉多大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 肝素硫酸盐的分离
- 组织样本的去脂化
注意：脱脂是富含脂肪组织的可选步骤。- 将甲醇与二氯甲烷按1:1比例混合。每份样品准备约500 μL；较大的组织块可能需要多达1 mL。
- 将每个组织样本放入带盖的小型玻璃容器中，用于脱脂。
注意：样品质量可能因目标组织和实验需求而异。通常50 mg或更少的样品即可获得足够的糖胺聚糖产量，但最终用户可能需要进行一些优化。 - 向每个玻璃容器中加入500 μL甲醇:二氯甲烷溶液并混匀。确保所有固体组织样本完全浸没在溶剂中。
注意：使用血清移液管或塑料锥形管混合和处理甲醇/二氯甲烷溶液；其他塑料材料可能溶解。 - 将样品置于化学通风橱内的固定摇床架上，轻轻振荡1小时。
- 振荡样品以充分混匀，然后在17,000 x g 4 °C下离心5分钟。
- 小心吸取有机溶剂层（上清液）。此为脂质组分，不含糖胺聚糖（GAGs），可弃去。
注意：尽量不要搅动组织，以免小块组织丢失。宁可将部分有机层保留在样本容器中，也不要因追求去除有机层而造成样本损失。 - 将玻璃容器的盖子....
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结果
阿利新蓝用于染色硫酸化糖胺聚糖（GAGs）10；后续使用银染可增强该信号11。图1直观展示了银染显色的发育过程。如图所示，随着显影剂渗入聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离后的GAGs所显示的阿利新蓝信号被放大。通常情况下，显影过程会以密度依赖的方式还原银染和阿利新蓝染色的GAGs，每条条带的边缘区域首先被还原，而中心染色较深的区域则最后着色。
文献中报道的基于PAGE方法检测糖胺聚糖（GAGs）的检测限范围为0.5–1 µg12,13。为确定本方法的检测限，将不同聚合度的硫酸乙酰肝素寡糖（未分级肝素、dp20、dp10、dp6）分别以1.0 µg和0.5 µg两种质量重复上样至22%聚丙烯酰胺凝胶中，随后按照前述方法进行电泳和染色。结果表明，本技术可清晰检测到0.5 µg纯化的GAG。
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讨论
糖胺聚糖（GAGs）在许多不同的生物学过程中起着核心作用。硫酸化GAGs（如HS和CS）的主要功能之一是与配体相互作用并结合，从而改变下游信号传导功能。GAG与其对应配体结合亲和力的一个重要决定因素是GAG聚合物链的长度8,9,14。因此，研究人员能够以合理的精确度确定从目标生物样本中分离出的GAG链的大小显得尤为重要。为了具备实用性，该技术应能够使用常见的实验室设备和试剂完成。
本方案描述了一种从生物样品中分离和纯化糖胺聚糖（GAGs）的方法，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）按分子大小进行分离，并利用阿利新蓝和银染技术对其进行可视化检测。尽管存在多种按大小分离糖胺聚糖的方法，但本方法在生命科学实验室的应用中具有若干独特优势。首先，该技术对GAGs的检测限可达0.5 µg，具有很高的灵敏度。根据我们的经验，即使是GAGs浓度相对较低的样品（例如支气管肺泡灌洗液样品），也能够通过本方法检测到足够量.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由 F31 HL143873-01（WBL）和 R01 HL125371（RJL 和 EPS）资助
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Accuspin Micro17 台式微量离心机 | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | 任何能够达到 14000 ×g 的台式微量离心机/转子组合均可使用 |
| 丙烯酰胺（固体） | thermoFisher Scientific | BP170-100 | 电泳级 |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | 来自 S. griseus 的蛋白酶混合物 |
| 阿利新蓝 8GX（固体） | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| 乙酸铵（固体） | thermoFisher Scientific | A639-500 | 分子生物学级 |
| 氢氧化铵（液体） | thermoFisher Scientific | A669S-500 | 符合 ACS 认证标准 |
| 过硫酸铵（固体） | thermoFisher Scientific | BP179-25 | 电泳级 |
| Barnstead GenPure Pro 水纯化系统 | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | 任何去离子/纯化水系统均可作为替代 |
| 硼酸（固体） | thermoFisher Scientific | A73-500 | 分子生物学级 |
| 溴酚蓝（固体） | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| 乙酸钙（固体） | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | 分子生物学级 |
| 氯化钙（固体） | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | 分子生物学级 |
| CHAPS 去垢剂（3-((3-胆酰胺丙基)二甲基铵)-1-丙磺酸盐） | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| 软骨素酶 ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion 空 PAGE 胶盒（1.0 mm 厚，12+2 孔） | Bio-Rad | 3459901 | 任何 1.0 mm 厚的 PAGE 制胶胶盒系统均可满足要求 |
| Criterion PAGE 电泳系统（电泳槽及电源） | Bio-Rad | 1656019 | 任何类似的垂直凝胶 PAGE 系统均可使用 |
| 二氯甲烷（液体） | thermoFisher Scientific | AC610931000 | 符合 ACS 认证标准 |
| 乙二胺四乙酸二钠盐（固体） | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | 分子生物学级 |
| 冰乙酸（液体） | thermoFisher Scientific | A35-500 | 符合 ACS 认证标准 |
| 甘氨酸（固体） | thermoFisher Scientific | G48-500 | 电泳级 |
| 肝素酶 I/III | Sigma Aldrich | H3917 | 来源于 Flavobacterium heparinum |
| 来源于肝素的十糖（dp10） | galen scientific | HO10 | |
| 来源于肝素的六糖（dp6） | Galen scientific | HO06 | |
| 来源于肝素的寡糖（dp20） | galen scientific | HO20 | |
| 盐酸（液体） | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| 冷冻干燥机 | Labconco | 7752020 | 任何能够达到 -40°C 和 0.135 Torr 的冷冻干燥机均可使用；也可用旋转式真空浓缩仪替代 |
| 甲醇（液体） | thermoFisher Scientific | A412-500 | 符合 ACS 认证标准 |
| Molecular Imager Gel Doc XR 凝胶成像系统 | Bio-Rad | 170-8170 | 任何类似的凝胶成像系统均可作为替代 |
| N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（固体） | thermoFisher Scientific | BP171-25 | 电泳级 |
| 酚红（固体） | thermoFisher Scientific | P74-10 | 游离酸形式 |
| Q Mini H 离子交换柱 | Vivapure | VS-IX01QH24 | 离子交换柱的最小上样体积应为 0.4 mL，工作 pH 范围为 2–12，且对 pKa 为 11 的离子基团具有选择性 |
| 硝酸银（固体） | thermoFisher Scientific | S181-25 | 符合 ACS 认证标准 |
| 乙酸钠（固体） | ThermoFisher Scientific | S210-500 | 分子生物学级 |
| 氯化钠（固体） | thermoFisher Scientific | S271-500 | 分子生物学级 |
| 氢氧化钠（固体） | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| 蔗糖（固体） | thermoFisher Scientific | BP220-1 | 分子生物学级 |
| TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺） | thermoFisher Scientific | BP150-20 | 电泳级 |
| Tris 碱（固体） | thermoFisher Scientific | BP152-500 | 分子生物学级 |
| 超滤离心管，0.5 mL，截留分子量 3000 Da | Amicon | UFC500324 | 可根据样品体积选用更大容量的滤膜装置。 |
| 尿素（固体） | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | 任何旋转式真空浓缩仪均可使用；也可用冷冻干燥机替代 |
| 真空滤器，一次性使用，孔径 0.22 µm，聚醚砜（PES）膜，容量 500 mL | thermoFisher Scientific | 569-0020 | 其他容量和滤膜材料亦可接受 |
参考文献
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan ....
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