Her demonstrerer vi en optimalisert teknikk for å vurdere sårreparasjon ved hjelp av ex vivo menneskelig hud kombinert med en helmontert farging tilnærming. Denne metodikken gir en preklinisk plattform for evaluering av potensielle sårbehandlinger.
Kroniske ikke-helbredende sår, som primært påvirker eldre og diabetikere, er et betydelig område med klinisk udekket behov. Dessverre er nåværende kroniske sårbehandlinger utilstrekkelige, mens tilgjengelige prekliniske modeller dårlig forutsier den kliniske effekten av nye terapier. Her beskriver vi en høy gjennomstrømning, preklinisk modell for å vurdere flere aspekter av den menneskelige hudreparasjonsresponsen. Delvis tykkelse sår ble opprettet i menneskelig ex vivo hud og dyrket over en helbredende tid kurs. Hudsårbiopsier ble samlet inn i fixative for hele monteringsfargingsprosedyren. Faste prøver ble blokkert og inkubert i primært antistoff, med deteksjon oppnådd via fluorescerende konjugert sekundært antistoff. Sår ble mottellert og avbildet via konfektmikroskopi før de beregnet prosentvis sårlukking (re-epithelialisering) i hver biopsi. Ved å bruke denne protokollen avslører vi at 2 mm eksisjonelle sår skapt i sunn donorhud er fullstendig re-epitelialisert ved dag 4-5 etter såring. Tvert imot reduseres lukkingsraten for diabetiske hudsår betydelig, ledsaget av forstyrret barrierereformering. Kombinere menneskelig hudsår med en ny helmontert farging tilnærming tillater en rask og reproduserbar metode for å kvantifisere ex vivo sår reparasjon. Samlet sett gir denne protokollen en verdifull menneskelig plattform for å evaluere effektiviteten av potensielle sårbehandlinger, transformere preklinisk testing og validering.
Kroniske, ikke-helbredende sår, som er svært utbredt hos eldre og diabetikere, er et stort uoppnåelig område med klinisk udekket behov. Disse sårene utgjør en stor fysisk og psykologisk byrde for pasienter og koster helsepersonell milliarder hvert år for å behandle1. Til tross for forbedret forståelse av sårbiologi og fremskritt innen teknologi, klarer opptil 40% av kroniske sår fortsatt ikke å helbrede etter beste standard omsorg2. Dermed krever 14-26% av pasienter med diabetiske fotsår deretter amputasjon3, mens 5-års post-amputasjonsdødelighet ligger på ca. 70%4. Som et resultat er det et presserende krav om å utvikle effektive nye terapier for å forbedre pasientens livskvalitet samtidig som den betydelige helsebyrden som pålegges av dårlige helbredende sår, reduseres. Dårlig prediktive prekliniske modeller er fortsatt et betydelig hinder for utviklingen av effektive nye terapier.
Sårreparasjon er en dynamisk og mangesidig prosess som involverer et mangfoldig utvalg av celletyper, utallige kommunikasjonsnivåer og et vevsmiljø som er temporally ombygd. Hudheling understøttes av fire store reparative stadier: hemostase, betennelse, spredning og matriseoppussing. Disse stadiene virker til slutt for å forhindre blodtap og infeksjon, lukk såroverflaten (en prosess som kalles re-epithelialisering) og returner huden til en uskadet tilstand5. Kroniske sår er forbundet med variert etiologi og utbredt perturbasjon til helbredelsesprosesser6, noe som ytterligere kompliserer identifiseringen av terapeutiske mål. Likevel er et bredt spekter av modeller utviklet for både å belyse molekylære og cellulære drivere av sårpatologi og teste nye terapeutiske tilnærminger7.
Den mest brukte sårreparasjonsmodellen er akutt såring i musen. Mus er svært gjennomførbare for mekanistiske studier og gir validerte modeller for aldring og diabetes8. Til tross for de generelle likhetene som vises blant mus og menneskelig helbredelse, forblir forskjeller mellom arter i hudstruktur og helbredende dynamikk. Dette betyr at de fleste murine sårforskning ikke lett oversettes til klinikken9. Følgelig har det vært et press mot menneskelige in vitro- og ex vivo-systemer med høy anvendbarhet og overførbarhet10,11.
Her gir vi en grundig protokoll for å utføre delvis tykkelse eksisjonelle sår i ex vivo menneskelig hud. Vi skisserer også vår helmonterte fargingstilnærming som en svært reproduserbar metode for å evaluere ex vivo menneskelig hudheling. Vi viser banen for epidermal reparasjon (re-epitelialisering) og påfølgende barrieredannelse, og evaluerer frekvensen av sårlukking i sunn versus diabetiker menneskelig hud. Til slutt demonstrerer vi hvordan helmontert farging kan tilpasses for bruk med en rekke antistoffer for å vurdere ulike aspekter av helbredelsesresponsen.
I denne eksperimentelle protokollen beskriver vi en optimalisert metode for evaluering av sårlukking i human eks vivo-hud ved hjelp av helmontert vevsfarging. Dette er en viktig ressurs for å tillate kritisk evaluering av potensielle sårbehandlinger, og for å gi bedre forståelse av den menneskelige sårreparasjonsresponsen. Vi har publisert helbredende vurdering i ex vivo hud sår tidligere12,13, men i disse rapportene ble hele mount farging tilnærming ikke brukt til å måle sårlukking. Helmontert farging er langt enklere og krever mindre teknisk erfaring enn standard histologi, som innebærer parafin- eller OCT-innebygging og seksjonering av prøver. Hele monteringsprosedyren reduserer også eksperimentell variasjon, noe som gjør det mulig å kvantifisere hele såret og ikke bare en enkelt tverrsnitt i en definert posisjon i vevet (se figur 4B for komparativ illustrasjon). Vi støtter fullt ut viktigheten av å kvantifisere helbredelse av hele ikke-symmetrisk sårstruktur, som tydelig skissert av Rhea og Dunnwald for murine akutte sår14. Disse forfatterne viste viktigheten av seriell seksjonering i vivo eksisjonelle sår for reproduserbare og presise målinger av sårmorfologi. Seriell seksjonering kan likeledes brukes på menneskelige ex vivo sår; Men for nøyaktig kvantifisering av sårlukking og re-epitelialisering, bør høy gjennomstrømning helmontert farging være den foretrukne metoden. Vi merker at denne helmonterte fargingsprotokollen også skal være kompatibel med etterfølgende behandling (voks eller OCT) for tradisjonell histologisk analyse.
Helmontert farging er ikke uten ulemper. Selv om det gir høyere reproduserbarhet i sårhelingsforsøk, krever det bruk av mer vev til analyse enn standard histologiske teknikker. Dette kan være et problem der vevstilgangen er begrenset, spesielt der flere antistoffer må vurderes. En alternativ tilnærming vil være å bruke en snittsårmetode der sårbredden er relativt jevn og variasjonen reduseres (som vist i mus og menneskelige sår15,16). Eksisjonssår forblir imidlertid mer anvendelige for de fleste patologiske sårtyper17.
I denne studien ble 2 mm delvis tykkelse sår opprettet i midten av 6 mm hudutløp. Denne metoden kan optimaliseres for alternative eksisjonssår og utvisningsstørrelser ved forskjellige huddybder18. I tillegg vil kraften som kreves for å generere sår variere mellom donorer, hvor alderen hud vil kreve mindre kraft til biopsi. Vi vil også unngå å bruke hud som viser fremtredende strekkmerker eller andre strukturelle endringer. Vi har validert en rekke antistoffer for å vurdere ulike aspekter av ex vivo healing respons. Denne protokollen kan også brukes med andre hudrelevante antistoffer, der antistoffkonsentrasjoner og inkubasjonstider må optimaliseres. Likevel mener vi at vår protokoll er mest egnet til absolutt kvantifisering av total sårlukking, etterfulgt av romlig vurdering av spesifikke proteiner av interesse. Mens helfestet gir redusert oppløsning av immunokalisering versus standard histologisk analyse av vevsseksjoner, gir den ytterligere 3D-informasjon som mangler fra standard 2D-histologi.
En advarsel om å vurdere helbredelse i ex vivo hud versus in vivo modeller er at det mangler en systemisk respons. Et viktig aspekt ved sårreparasjon er betennelse og etterfølgende vevgranulering, som skyldes en tilstrømning av inflammatoriske celler og endotelceller fra vaskulaturen19. Til tross for denne begrensningen gir ex vivo hud fortsatt en bedre recapitulation av klinisk helbredelse enn cellebaserte såranalyser. In vitro eksperimenter generelt involverer single cell type monolayers eller co-kulturer dyrket på vev kultur plast, mens ex vivo hud gir et innfødt miljø for å utforske celle atferd. Mer nylig har en rekke hudekvivalente systemer dukket opp, hvor huden dyrkes i et laboratorium fra kunstig matrise og isolerte hudceller20,21. Selv om disse modellene etterligner menneskelig hud bedre enn de fleste in vitro-tilnærminger, simulerer de fortsatt ikke det opprinnelige vevsmiljøet fullt ut og er generelt for skjøre til å skade reprodusert. I tillegg har vi (og andre) vist at ex vivo menneskelig hudvev beholder bosatte immunceller, noe som uten tvil vil bidra til å reparere22,23. Fremtidig arbeid bør nå fokusere på å utvide levedyktigheten og immunokogeniteten til ex vivo-modellen for senfasehelingsvurdering24. Et alternativ er videreutvikling av lovende organ-on-a-chip-teknologier som er i stand til å forlenge vevs levedyktighet og opprettholde innfødt hudarkitektur i opptil to uker i kultur25. Ex vivo-modeller har også begynt å vurdere viktigheten av hudinflammatorisk respons ved å lykkes med å inkorporere immunceller, som nøytrofiler, i vertsvevet26 eller injisere vertsvev med antistoffer for å fremkalle en immunreaksjon27. Vi forventer at disse funnene vil bane vei for utvikling av mer raffinerte og overførbare metoder i fremtiden.
En stor fordel med å bruke ex vivo hud for å måle sårlukking er evnen til å sammenligne helbredende rater i sunt (f.eks. ikke-diabetiker) versus patologisk (f.eks. diabetiker eller alderen) vev. Her viste vi at re-epithelialisering og barrieredannelse faktisk er svekket i diabetiker versus sunne ex vivo sår. Faktisk gir dette en rute for preklinisk vurdering av patologisk reparasjon, hvor aldring og diabetes er viktige risikofaktorer for å utvikle kroniske sår1. Mens in vitro patologiske modeller eksisterer, for eksempel celler isolert fra alderen og diabetisk vev, eller celler dyrket i høy glukose for å etterligne hyperglykemi28,29, kan disse cellene raskt miste sin fenotype når de er fjernet fra in vivo mikromiljøet. En viktig komponent i det ekstrinsiske patologiske helbredende miljøet er dermal matrise, som endres i både aldring og diabetes30. Faktisk påvirker denne perturberte matrisen oppførselen til bosatte og naive fibroblaster31,32. Dermed kan viktigheten av å studere celler i vertsvevsmiljøet ikke undervurderes.
Oppsummert gir vår protokoll en viktig plattform for å kvantifisere menneskelig sårre-epitelialisering, utforske regulatoriske faktorer og for å teste gyldigheten og effekten av potensielle terapeutiskestoffer 12,13. Mens preklinisk testing fortsatt krever in vivo-tilnærminger, bør en kombinert strategi ved hjelp av ex vivo humant vev og in vivo murine wounding foredle den prekliniske banen, redusere dyrebruken samtidig som kryssartene oversettes.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke Mr Paolo Matteuci og Mr George Smith for å gi pasientvev. Vi er også takknemlige til Miss Amber Rose Stafford for å bistå med vevsinnsamling og Daisy Appeal for å tilby laboratoriefasiliteter.
50 mL Falcon Tubes | Falcon | 352070 | For skin washing |
1.5 ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile) | Starlab | S1615-5510 | For whole-mount staining |
48-Well CytoOne Plate, TC-Treated | Starlab | CC7682-7548 | For whole-mount staining |
Acetic Acid Glacial | Fisher Chemical | A/0400/PB15 | Part of fixative |
Alkyltrimethylammonium Bromide | Sigma-Aldrich | M7635 | Part of fixative |
Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4] | Abcam | ab7817 | Stains blood vessels |
Anti-Collagen I Antibody | Abcam | ab34710 | Stains collagen |
Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002] | Abcam | ab7800 | Stains epidermis |
CD1A Antibody (CTB6) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5265 | Stains Langerhans cells |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 62247 | Counterstain for cell nuclei |
Falcon 60mm Petri dishes | Falcon | 353004 | Human ex vivo culture |
Fibronectin Antibody (EP5) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8422 | Stains fibronectin |
Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR | Fisher Chemical | F/1501/PB17 | Part of fixative |
Gauze Swabs | Medisave | CS1650 | To clean skin |
Gibco™ Antibiotic-Antimycotic Solution | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Human ex vivo culture |
Gibco DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960044 | Human ex vivo culture |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Human ex vivo culture |
Gibco HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170088 | Human ex vivo culture |
Gibco L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Human ex vivo culture |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | For immunoperoxidase staining |
ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | For image analysis |
Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody |
Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11012 | Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody |
Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | For viability assessment of tissue |
Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1×2 teeth | World Precision Instruments | 15917 | To create wounds |
Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 501264 | To create wounds |
Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 501263 | To remove adipose tissue |
Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified | Biolegend | 905201 | Stains epidermis |
Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified | Biolegend | 905301 | Stains epidermis |
LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | Discontinued | For fluorescent imaging |
Merck Millipore Absorbent pads | Merck Millipore | AP10045S0 | Human ex vivo culture |
Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters | Merck Millipore | HNWP04700 | Human ex vivo culture |
Normal Goat Serum Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | Animal serum used depends on secondary antibody |
Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P3619 | For wash buffer |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | For blocking buffer |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | Part of fixative |
Sterilisation Pouches | Medisave | SH3710 | To sterilise instruments |
Stiefel 2mm biopsy punches | Medisave | BI0500 | For partial thickness wound |
Stiefel 6mm biopsy punches | Medisave | BI2000 | For outer explant |
Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | To prepare skin |
Triton X-100 | Fisher Chemical | T/3751/08 | For wash buffer |
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody |
Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories | SK-4800 | For immunoperoxidase staining |
Wireless Digital Microscope | Jiusion | N/A | For brightfield imaging |