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Immunology and Infection

Gene Knock-in durch CRISPR/Cas9 und Zellsortierung in Makrophagen- und T-Zelllinien

Published: November 13, 2021
doi:
10.3791/62328
, , , , , , , , ,
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Université

Summary

Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Reporter und Zellsortierung, um Knock-in-Experimente in Makrophagen- und T-Zelllinien zu vereinfachen. Für diese vereinfachten Knock-in-Experimente werden zwei Plasmide verwendet, nämlich ein CRISPR/Cas9- und DsRed2-exprimierendes Plasmid und ein homologes Rekombinationsspenderplasmid, das EBFP2 exprimiert, das dauerhaft am Rosa26-Locus in Immunzellen integriert ist.

Abstract

Funktionelle Genomik-Studien des Immunsystems erfordern genetische Manipulationen, die sowohl die Deletion von Zielgenen als auch die Zugabe von Elementen zu interessierenden Proteinen beinhalten. Die Identifizierung von Genfunktionen in Zelllinienmodellen ist wichtig für die Genentdeckung und Erforschung zellintrinsischer Mechanismen. Genetische Manipulationen von Immunzellen wie T-Zellen und Makrophagenzelllinien mit CRISPR/Cas9-vermitteltem Knock-in sind jedoch aufgrund der geringen Transfektionseffizienz dieser Zellen, insbesondere in einem Ruhezustand, schwierig. Um Gene in Immunzellen zu modifizieren, werden typischerweise Arzneimittelresistenzselektion und virale Vektoren verwendet, um Zellen anzureichern, die das CRIPSR / Cas9-System exprimieren, was unweigerlich zu unerwünschten Eingriffen der Zellen führt. In einer früheren Studie haben wir duale fluoreszierende Reporter entwickelt, die mit CRISPR/Cas9 gekoppelt sind und nach der Elektroporation vorübergehend exprimiert wurden. Diese technische Lösung führt zu einer schnellen Genselöschung in Immunzellen; Das Einklopfen von Genen in Immunzellen wie T-Zellen und Makrophagen ohne den Einsatz von Arzneimittelresistenzselektion oder viralen Vektoren ist jedoch noch schwieriger. In diesem Artikel zeigen wir, dass durch die Verwendung von Zellsortierung zur Unterstützung der Selektion von Zellen, die transient CRISPR/Cas9-Konstrukte exprimieren, die auf den Rosa26-Locus in Kombination mit einem Spenderplasmid abzielen, ein Gen-Knock-in sowohl in T-Zellen als auch in Makrophagen ohne Arzneimittelresistenzanreicherung erreicht werden kann. Als Beispiel zeigen wir, wie man menschliches ACE2, einen Rezeptor von SARS-Cov-2, der für die aktuelle Covid-19-Pandemie verantwortlich ist, in RAW264.7-Makrophagen durch Knock-in-Experimente exprimiert. Solche Gen-Knock-in-Zellen können häufig für mechanistische Studien verwendet werden.

Introduction

Immunzellen sind entscheidend für die Abwehr von Krankheitserregern. Sowohl angeborene als auch adaptive Immunität sind für die Clearance von Infektiva und die Aufrechterhaltung der Gewebeöostase erforderlich1,2. Zelllinienmodelle sind wesentliche Werkzeuge, um die molekularen Grundlagen des Immunsystems von Säugetieren zu verstehen. Sie werden in funktionellen In-vitro-Assays verwendet, z. B. bei der Modellierung der Aktivierung menschlicher T-Zellen und bei der Bestimmung der Funktion genetischer Faktoren bei der Aktivierung oder Dämpfung von Immunantworten3,4. Es ist wichtig zu beachten, dass das Immunsystem von Säugetieren enorm heterogen ist und, ebenso wichtig, eine große Anzahl von Molekülen die Differenzierung, Migration und Funktion eines bestimmten Zelltyps5,6steuert.

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 Genome Editing Tools ermöglichen die genetische Manipulation bestimmter Zelltypen, was die funktionelle Annotation von Genen auf präzise Weise erleichtert7,8. Mehrere veröffentlichte Protokolle haben die Abgabe von CRISPR/Cas9 in Form von Cas9-Guide-RNA-Komplexen beschrieben, die als Ribonukleoproteine (RNPs) in HEK293-Zellen, Jurkat-Zelllinien, primären T-Zellen9,10, Makrophagen11,12,13, Stammzellen14und anderen15,16bekannt sind . In diesen Protokollen wird das Gen-Tagging normalerweise durch Verschmelzen eines fluoreszierenden Tags mit endogenen Proteinenerreicht 17,18. Es wurden jedoch nur wenige Versuche unternommen, duale fluoreszierende Reporter zu verwenden, die mit der Einzelzellsortierung kompatibel sind, um Knock-in-Experimente19,20, insbesondere in Immunzellen , zu erleichtern.

Eingehende mechanistische Analysen, die darauf abzielen, die Funktionen eines neuartigen genetischen Faktors in Immunzellen zu verstehen, erfordern in der Regel eine zelltypspezifische Deletion eines Gens, genetische Rettungsexperimente und idealerweise die Identifizierung seiner Interaktoren. Obwohl Methoden zur Optimierung der genetischen Deletion von Genen in Immunzellen veröffentlicht wurden9,15,21, wurden weit weniger Methoden zur Einführung von Knock-in-Allelen mit vielseitigen Funktionen zum Verständnis der Immunantwort berichtet. Daher wollen wir in diesem Protokoll ein effizientes und hochreproduzierbares Protokoll beschreiben, um ein Protein von Interesse (POI) am Safe-Harbor-Locus Rosa26 sowohl in menschlichen als auch in murinen Immunzelllinien zu exprimieren. Wir haben ein zweifarbiges Reportersystem entwickelt, um Zellen anzureichern, die mit Plasmiden transfiziert sind, die CRISPR/Cas9 (DsRed2) exprimieren, und eine rekombinante DNA-Vorlage (EBFP2), die durch Zellsortierung isoliert werden kann. Nach diesem Protokoll erhielten wir mehrere Knock-in-Linien der menschlichen T-Zelllinie Jurkat und des murinen Makrophagen RAW264.7 für funktionelle Analysen von schlecht untersuchten Proteinen.

Als Beispiel zeigen wir in diesem Protokoll, wie man Knock-in RAW264.7 Makrophagen erhält, die stabil menschliches ACE2 (ein Rezeptor von SARS-Cov-2)22exprimieren. Da angeborene Immunzellen an der Pathogenese von Covid-1923beteiligt sind,24 und humanes ACE2 als hauptrezeptor gilt, der für den viralen Eintritt in Zellen vor der Replikation benötigt wird, können Makrophagen mit Knock-in von humanem ACE2 als nützliches Werkzeug für mechanistische Studien der viralen Vermehrung in Makrophagen dienen. Parallel dazu präsentieren wir auch ein Beispiel für das Einschalten eines Gens am menschlichen ROSA26-Locus, um das RASGRP1-Protein zu exprimiert, das an seinem Aminoterminus mit einem Affinitäts-Twin-Strep-Tag (OST) verschmolzen wurde. T-Zellen sind wichtige Zielzellen in Immuntherapien, und eine zunehmende Anzahl von Studien hat sich auf die Manipulation ihrer Reaktionsfähigkeit auf Krebs konzentriert25,26. Da Rasgrp1 als schlüsselhaftes Signalmolekül nach dem T-Zell-Rezeptor bekannt ist und seine Interaktoren nicht gut aufgeklärt sind27, bietet das OST-RASGRP1-Knock-in-Modell die Grundlage für die Identifizierung von Interaktoren, die die Reaktion von T-Zellen auf Tumore und Infektionen regulieren. Zusammengenommen können diese Werkzeuge für Covid-19-Studien und die Entdeckung neuartiger Moleküle verwendet werden, die mit Rasgrp1 interagieren.

Protocol

1. Design und Plasmidkonstruktion von sgRNAs für Rosa26 Locus Designleitfaden-RNAs rund um die gewünschte Einfügestelle Stellen Sie sicher, dass sich die Einfügestelle für Rosa26-Knock-in-Experimente der Maus Rosa26 (im Folgenden als mRosa26bezeichnet) im ersten Intron von mRosa26befindet. Diese Seite wurde in früheren Studien verwendet28,29. Stellen Sie bei Knock-in-…

Representative Results

Nach dem oben beschriebenen Protokoll zur Durchführung von Knock-in-Experimenten am mRosa26-Locus mit murinen RAW264.7-Makrophagen haben wir einen Zielvektor entwickelt, um menschliches ACE2, einen Rezeptor für das SARS-Cov-2-Virus, zu exprimiert (Abbildung 2A). Mit einem ähnlichen Design erzeugten wir menschliche Jurkat-T-Zellen mit Knock-In des OST-markierten RASGRP1-Fusionsproteins (Abbildung 2C). Nach der Transfektion von drei Plasmiden, von dene…

Discussion

In unseren Experimenten haben wir gezeigt, wie man Knock-in-Editing in Immunzellen vom Konstruktdesign bis zum Knock-in-Zellscreening und Validierung am Beispiel menschlicher Jurkat-T-Zellen und muriner RAW264.7-Makrophagen durchführt. Sowohl T-Zell- als auch Makrophagen-Zelllinien sind resistent gegen Transfektion36,37; Das Problem der geringen Effizienz der CRISPR/Cas9-Abgabe kann jedoch mit Hilfe von fluoreszierenden Reportern in Verbindung mit der Zellsortie…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken der Durchflusszytometrie-Kerneinrichtung der Xinxiang Medical University. Die Entwicklung einer solchen Technologie wurde durch NSFC-Zuschüsse 81601360 an LZ, 81471595 und 32070898 an YL unterstützt. Die Arbeit wird auch von der Stiftung des Henan Educational Committee Nr. 21IRTSTHN030 unterstützt.

Materials

Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799
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References

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