Summary

Cirkulerande tumör cellinjer: ett innovativt verktyg för grundläggande och translationell forskning

Published: December 25, 2021
doi:

Summary

Odling ctcs möjliggör en djupare funktionell karakterisering av cancer, genom att analysera specifika markör uttryck, och bedöma läkemedelsresistens och förmågan att kolonisera levern bland andra möjligheter. Sammantaget kan CTC-kulturen vara ett lovande kliniskt verktyg för personlig medicin för att förbättra patientens resultat.

Abstract

Metastasering är en ledande orsak till cancerdöd. Trots förbättringar i behandlingsstrategier har metastaserad cancer en dålig prognos. Vi står därför inför ett akut behov av att förstå mekanismerna bakom metastaseringsutveckling och därmed föreslå effektiva behandlingar för avancerad cancer. Metastaserande cancer är svåra att behandla, eftersom tarmbiopsier är invasiva och otillgängliga. Nyligen har det funnits ett stort intresse för flytande tarmbiopsier inklusive både cellfri cirkulerande deoxyribonukleinsyra (DNA) och cirkulerande tumörceller från perifert blod och vi har etablerat flera cirkulerande tumör cellinjer från metastaserade kolorektalcancerpatienter för att delta i deras karakterisering. För att funktionellt karakterisera dessa sällsynta och dåligt beskrivna celler är det avgörande steget att expandera dem. När det har etablerats kan cirkulerande tumörcelllinjer (CTC) sedan odlas i suspension eller vidhäftande förhållanden. På molekylär nivå kan CTC-linjer användas ytterligare för att bedöma uttryck av specifika markörer av intresse (såsom differentiering, epitelial eller cancerstamceller) genom immunofluorescens- eller cytometrianalys. Dessutom kan CTC-linjer användas för att bedöma läkemedelskänslighet mot guldstandard kemoterapier samt riktade terapier. Förmågan hos CTC linjer att initiera tumörer kan också testas genom subkutan injektion av CTC i immunodeficient möss.

Slutligen är det möjligt att testa rollen av specifika gener av intresse som kan vara involverade i cancerspridning genom att redigera CTC-gener, med kort hårnål ribonukleinsyra (shRNA) eller Crispr /Cas9. Modifierade CTC kan således injiceras i immunbristmus mjältar, för att experimentellt efterlikna en del av den metastaserande utvecklingsprocessen in vivo.

Sammanfattningsvis är CTC-linjer ett värdefullt verktyg för framtida forskning och för personlig medicin, där de kommer att möjliggöra förutsägelse av behandlingseffektivitet med hjälp av just de celler som ursprungligen är ansvariga för metastasering.

Introduction

Trots de senaste förbättringarna i tidig cancerdiagnos och i terapeutisk strategi beror mer än nittio procent av cancersjuklighet fortfarande på metastasering1. Den metastaserade processen är en flerstegskaskad som börjar med lokal frigörelse av celler från den primära tumören och deras ingång i blodomloppet där de blir cirkulerande tumörceller (CTC) för att slutligen kolonisera avlägsna platser som lever och lungor, vid kolorektal cancer (CRC)2. Nyligen har det varit växande uppmärksamhet på flytande tarmbiopsier, som är ett icke-invasivt verktyg för att särskilt upptäcka och räkna upp CTC från patientens blodprover. Intratumor genetisk heterogenitet är en viktig orsak till läkemedelsresistens; således utgör isolering av representativa celler från tumörmaterial ett lovande verktyg för personlig medicin3.

Trots låg frekvens av CTC i blodet (1 CTC per 106 – 107 leukocyter)4utvecklades flera detektions- och isoleringstekniker baserat på egenskapsskillnader mellan CTC och andra komponenter i blodet5. Antalet CTC i patientblodprover kan ensamt ge information om malignitetsstadiet, behandlingssvaret och sjukdomsprogression6,7. Således är CTC-isolering ett viktigt verktyg för translationella studier för att bedöma genetisk heterogenitet eller utföra läkemedelsscreening, liksom för grundläggande studier för att karakterisera dessa invasiva celler, eftersom de är nyckelaktörerna för metastaserad induktion8,9. Jämfört med kommersiellt etablerade cancer cellinjer som har ackumulerat tusentals mutationer över tiden, nya CTC delar huvuddragen i den ursprungliga primära tumören inklusive en potent kapacitet att metastasera, och de är en bättre återspegling av sjukdomen. Dessa funktioner gör dem till ett robust verktyg för grundläggande studier, särskilt i knockout experiment av förutsagda nyckelfaktorer som är involverade i metastasering. Resultatet av dessa experiment kan valideras in vivo, på möss, enligt beskrivningen nedan.

När CTC har isolerats kan de utökas under icke-vidhäftande odlingsförhållanden och sedan kan de manipuleras precis som alla tillgängliga cancercelllinjer, dvs. de kan också odlas under vidhäftande förhållanden eller bäddas in i Matrigel, beroende på den vetenskapliga frågan10. Till exempel, för att testa uttrycket och lokaliseringen av ett protein av intresse, kan CTC-sfärer odlas i suspensionstillstånd och bäddas in i Histogel för att utföra immunofluorescens på sfärsektioner. Dessutom, om proteinet är membranous, kan dess uttryck på levande celler mätas med cytometri.

För funktionella studier, för att testa rollen av ett protein av intresse som kan spela en roll i lever kolonisering, CTC med gener redigeras, genom shRNA eller CRISPR/Cas9, kan injiceras i mjälten av immunodeficient möss. Detta senare experiment är en kraftfull modell för att efterlikna levermetastaskolonisering11.

CtCs förmåga att initiera tumörer kan bedömas genom att injicera ett mycket litet antal celler i immunbrist möss. Eftersom tumörinitiering är ett kännetecken för cancerstamceller (CSCs) kommer denna analys att indikera andelen CSCs inom CTC-linjer. Denna stamcellsfenotyp gör cirkulerande tumör cellinjer resistenta mot vissa guldstandard cancerbehandlingar. Utökade CTC kan därför användas för att screena läkemedel och fastställa den bästa möjliga effektiva behandlingen för patienten. CTC-svar på behandling kan testas in vitro med hjälp av en luminiscens lönsamhetsanalys, till exempel.

I ett långsiktigt perspektiv skulle läkemedelsscreening på nyisolerade och förstärkta CTC kunna användas som ett nytt verktyg för personlig medicin för att hjälpa till att välja den mest effektiva och anpassade behandlingen för patienter.

I det här dokumentet beskrivs protokoll för att odla CTC-linjer, för att färga specifika proteiner via immunstaining och cytometri, för att utföra cytotoxicitetsanalyser samt in vivo xenograft experiment med CTC.

Protocol

Alla in vivo-protokoll godkändes av de djuretiska organen. 1. CTC-förstärkning i 3D-odlingsförhållanden För att odla CTC i suspension, första frö CTC i brunnar av en Ultra-Low Attachment (ULA) 24-brunnsplatta vid maximal koncentration av 5 celler/μL och i 1 mL M12 medium (dvs avancerat DMEM-F12 kompletterat med 2 mM l-glutamin,100Unit/mL penicillin och streptomycin, N2 tillägg, 20 ng/mL epidermal tillväxtfaktor). För att …

Representative Results

Både EpCAM- och CD26-uttryck som observerats av IF(figur 1A höger panel) respektive FACS ( figur1B) anger att CTC-linjen är epiteliell och visar ett av CSC-kännetecknen10. Detta epitelial drag kan ytterligare karakteriseras av färgning med antikroppar riktade mot andra epitelial och mesenchymal markörer. Därmed kan det vara möjligt att ungefär veta var CTC-linjen är längs epitelial-mesenkymalaxeln. Uttryck av a…

Discussion

Protokollet som beskrivs ovan användes ursprungligen för kolorektal CTC funktionell karakterisering, men det kan användas för andra typer av cancer såsom bröstcancer och kan anpassas för musmodeller.

Den verkliga begränsande faktorn är antalet CTC som finns i blodprovet och effektiviteten hos den teknik som används för att isolera och expandera dem. Flera CTC-isoleringsteknik har beskrivits baserat på specifika CTC-egenskaper som Parsortix, en mikrofluidisk enhet, som möjliggör i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta forskningsprojekt i Pannequin-labbet stöddes av forskningsanslag från SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Doktorsavhandlingarna av Guillaume Belthier och Zeinab Homayed stöddes av anti-cancerligan/Ligue contre le Cancer. Céline Boucliers lön finansierades av “region Occitanie”. Tack till Julian Venables för engelsk redigering.

Materials

Accumax solution Sigma-Aldrich A7089
Advanced DMEM/F-12 Gibco 12634028
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Promega G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 354230
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Corning 3473
Histiogel Specimen Medium LabStorage HG-4000
Human EGF, premium grade Miltenyi Biotec 130-097-751
Human FGF-2, premium grade Miltenyi Biotec 130-093-564
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030081
N-2 Supplement Gibco 17502048
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Gibco 15070063

References

  1. Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, 14-16 (2005).
  2. Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
  3. Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
  4. Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
  5. vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
  6. Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
  7. Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
  8. Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
  9. Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
  10. Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
  11. Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
  12. Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
  13. Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
  14. Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician’s guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
  15. Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
  16. Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
check_url/62329?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Belthier, G., Homayed, Z., Bouclier, C., Asari, M., Pannequin, J. Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research. J. Vis. Exp. (178), e62329, doi:10.3791/62329 (2021).

View Video