Odling ctcs möjliggör en djupare funktionell karakterisering av cancer, genom att analysera specifika markör uttryck, och bedöma läkemedelsresistens och förmågan att kolonisera levern bland andra möjligheter. Sammantaget kan CTC-kulturen vara ett lovande kliniskt verktyg för personlig medicin för att förbättra patientens resultat.
Metastasering är en ledande orsak till cancerdöd. Trots förbättringar i behandlingsstrategier har metastaserad cancer en dålig prognos. Vi står därför inför ett akut behov av att förstå mekanismerna bakom metastaseringsutveckling och därmed föreslå effektiva behandlingar för avancerad cancer. Metastaserande cancer är svåra att behandla, eftersom tarmbiopsier är invasiva och otillgängliga. Nyligen har det funnits ett stort intresse för flytande tarmbiopsier inklusive både cellfri cirkulerande deoxyribonukleinsyra (DNA) och cirkulerande tumörceller från perifert blod och vi har etablerat flera cirkulerande tumör cellinjer från metastaserade kolorektalcancerpatienter för att delta i deras karakterisering. För att funktionellt karakterisera dessa sällsynta och dåligt beskrivna celler är det avgörande steget att expandera dem. När det har etablerats kan cirkulerande tumörcelllinjer (CTC) sedan odlas i suspension eller vidhäftande förhållanden. På molekylär nivå kan CTC-linjer användas ytterligare för att bedöma uttryck av specifika markörer av intresse (såsom differentiering, epitelial eller cancerstamceller) genom immunofluorescens- eller cytometrianalys. Dessutom kan CTC-linjer användas för att bedöma läkemedelskänslighet mot guldstandard kemoterapier samt riktade terapier. Förmågan hos CTC linjer att initiera tumörer kan också testas genom subkutan injektion av CTC i immunodeficient möss.
Slutligen är det möjligt att testa rollen av specifika gener av intresse som kan vara involverade i cancerspridning genom att redigera CTC-gener, med kort hårnål ribonukleinsyra (shRNA) eller Crispr /Cas9. Modifierade CTC kan således injiceras i immunbristmus mjältar, för att experimentellt efterlikna en del av den metastaserande utvecklingsprocessen in vivo.
Sammanfattningsvis är CTC-linjer ett värdefullt verktyg för framtida forskning och för personlig medicin, där de kommer att möjliggöra förutsägelse av behandlingseffektivitet med hjälp av just de celler som ursprungligen är ansvariga för metastasering.
Trots de senaste förbättringarna i tidig cancerdiagnos och i terapeutisk strategi beror mer än nittio procent av cancersjuklighet fortfarande på metastasering1. Den metastaserade processen är en flerstegskaskad som börjar med lokal frigörelse av celler från den primära tumören och deras ingång i blodomloppet där de blir cirkulerande tumörceller (CTC) för att slutligen kolonisera avlägsna platser som lever och lungor, vid kolorektal cancer (CRC)2. Nyligen har det varit växande uppmärksamhet på flytande tarmbiopsier, som är ett icke-invasivt verktyg för att särskilt upptäcka och räkna upp CTC från patientens blodprover. Intratumor genetisk heterogenitet är en viktig orsak till läkemedelsresistens; således utgör isolering av representativa celler från tumörmaterial ett lovande verktyg för personlig medicin3.
Trots låg frekvens av CTC i blodet (1 CTC per 106 – 107 leukocyter)4utvecklades flera detektions- och isoleringstekniker baserat på egenskapsskillnader mellan CTC och andra komponenter i blodet5. Antalet CTC i patientblodprover kan ensamt ge information om malignitetsstadiet, behandlingssvaret och sjukdomsprogression6,7. Således är CTC-isolering ett viktigt verktyg för translationella studier för att bedöma genetisk heterogenitet eller utföra läkemedelsscreening, liksom för grundläggande studier för att karakterisera dessa invasiva celler, eftersom de är nyckelaktörerna för metastaserad induktion8,9. Jämfört med kommersiellt etablerade cancer cellinjer som har ackumulerat tusentals mutationer över tiden, nya CTC delar huvuddragen i den ursprungliga primära tumören inklusive en potent kapacitet att metastasera, och de är en bättre återspegling av sjukdomen. Dessa funktioner gör dem till ett robust verktyg för grundläggande studier, särskilt i knockout experiment av förutsagda nyckelfaktorer som är involverade i metastasering. Resultatet av dessa experiment kan valideras in vivo, på möss, enligt beskrivningen nedan.
När CTC har isolerats kan de utökas under icke-vidhäftande odlingsförhållanden och sedan kan de manipuleras precis som alla tillgängliga cancercelllinjer, dvs. de kan också odlas under vidhäftande förhållanden eller bäddas in i Matrigel, beroende på den vetenskapliga frågan10. Till exempel, för att testa uttrycket och lokaliseringen av ett protein av intresse, kan CTC-sfärer odlas i suspensionstillstånd och bäddas in i Histogel för att utföra immunofluorescens på sfärsektioner. Dessutom, om proteinet är membranous, kan dess uttryck på levande celler mätas med cytometri.
För funktionella studier, för att testa rollen av ett protein av intresse som kan spela en roll i lever kolonisering, CTC med gener redigeras, genom shRNA eller CRISPR/Cas9, kan injiceras i mjälten av immunodeficient möss. Detta senare experiment är en kraftfull modell för att efterlikna levermetastaskolonisering11.
CtCs förmåga att initiera tumörer kan bedömas genom att injicera ett mycket litet antal celler i immunbrist möss. Eftersom tumörinitiering är ett kännetecken för cancerstamceller (CSCs) kommer denna analys att indikera andelen CSCs inom CTC-linjer. Denna stamcellsfenotyp gör cirkulerande tumör cellinjer resistenta mot vissa guldstandard cancerbehandlingar. Utökade CTC kan därför användas för att screena läkemedel och fastställa den bästa möjliga effektiva behandlingen för patienten. CTC-svar på behandling kan testas in vitro med hjälp av en luminiscens lönsamhetsanalys, till exempel.
I ett långsiktigt perspektiv skulle läkemedelsscreening på nyisolerade och förstärkta CTC kunna användas som ett nytt verktyg för personlig medicin för att hjälpa till att välja den mest effektiva och anpassade behandlingen för patienter.
I det här dokumentet beskrivs protokoll för att odla CTC-linjer, för att färga specifika proteiner via immunstaining och cytometri, för att utföra cytotoxicitetsanalyser samt in vivo xenograft experiment med CTC.
Protokollet som beskrivs ovan användes ursprungligen för kolorektal CTC funktionell karakterisering, men det kan användas för andra typer av cancer såsom bröstcancer och kan anpassas för musmodeller.
Den verkliga begränsande faktorn är antalet CTC som finns i blodprovet och effektiviteten hos den teknik som används för att isolera och expandera dem. Flera CTC-isoleringsteknik har beskrivits baserat på specifika CTC-egenskaper som Parsortix, en mikrofluidisk enhet, som möjliggör i…
The authors have nothing to disclose.
Detta forskningsprojekt i Pannequin-labbet stöddes av forskningsanslag från SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Doktorsavhandlingarna av Guillaume Belthier och Zeinab Homayed stöddes av anti-cancerligan/Ligue contre le Cancer. Céline Boucliers lön finansierades av “region Occitanie”. Tack till Julian Venables för engelsk redigering.
Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |