פרויקט מדעי אזרחי תוכנן לגייס את תושבי סן דייגו לאסוף דגימות סביבתיות עבור SARS-CoV-2. פלטפורמה רב-לשונית מבוססת אינטרנט נוצרה לשליחת נתונים באמצעות ממשק מכשיר נייד ידידותי למשתמש. מערכת ניהול מידע במעבדה אפשרה איסוף של אלפי דגימות מגוונות גיאוגרפית עם מעקב אחר תוצאות בזמן אמת.
כדי לשלוט בהעברת הקהילה של תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) במהלך המגפה העולמית 2020, רוב המדינות יישמו אסטרטגיות המבוססות על בדיקות אנושיות ישירות, כיסוי פנים וחיטוי משטחים. תחת ההנחה כי נתיב השידור העיקרי כולל אירוסולים וטיפות נשימה, המאמצים לאתר SARS-CoV-2 ב fomites התמקדו במקומות החשודים בשכיחות גבוהה (למשל, מחלקות בית חולים, ספינות שייט, ומערכות הסעת המונים). כדי לחקור את נוכחותם של SARS-CoV-2 על משטחים בסביבה העירונית כי הם לעתים רחוקות ניקה ורק לעתים רחוקות חיטוי, 350 אזרחים גויסו ממחוז סן דייגו רבתי. בסך הכל, מדענים אזרחיים אלה אספו 4,080 דגימות. פלטפורמה מקוונת פותחה כדי לפקח על משלוח ערכת דגימה ואיסוף, כמו גם לאסוף נתונים לדוגמה. ערכות הדגימה נבנו ברובן מאספקה הזמינה בחנויות לחוצות מגפה. דגימות עובדו באמצעות ריאגנטים שהיו קלים לגישה למרות המחסור החוזר ונשנה באספקה. השיטות בהן נעשה שימוש היו רגישות מאוד ועמידות בפני מעכבים הנמצאים בדרך כלל בדגימות סביבתיות. שיטות התכנון והעיבוד הניסיוניות המוצעות הצליחו לערב מדענים אזרחיים רבים שאספו ביעילות דגימות משטחים מגוונים. זרימת העבודה והשיטות המתוארות כאן רלוונטיות לסקר את הסביבה העירונית עבור וירוסים אחרים, אשר מהווים דאגה לבריאות הציבור ומהווים איום למגפות עתידיות.
SARS-CoV-2 הוא חשב להיות מועבר בעיקר באמצעות שאיפה של אירוסולים מזוהמים טיפות ממגע ישיר עם אנשים נגועים1,2,3,4. עם זאת, בשלבים הראשונים של מגפת COVID-19 העולמית, המאמצים לשלוט בהעברת SARS-CoV-2 התמקדו מאוד בחיטוי משטחים, שטיפת ידיים וחיטוי. עד סוף 2020, הנחיות שידור מארגון הבריאות העולמי (WHO)5 והמרכזים האמריקניים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC)6 נחשבים שידור מוטס סכנה בעיקר כאשר במגע הדוק (<2 מ ') עם אדם נגוע או בנוכחות הליכים רפואיים מייצרי תרסיס. חיסון עצמי לאחר מגע עם משטחים מזוהמים או שאיפה של fomites תרסיס עדיין לא נשללו כמסלול של שידור של SARS-CoV-2.
דווח על מקרי COVID-19 שבהם שידור מוטס נראה לא סביר7,8. SARS-CoV-2 virions להישאר זיהומיות על נחושת עד 8 שעות, על קרטון ופלדת אל-חלד עד 24 שעות, ועל פלסטיק עד 48 שעות9. בבקתות ספינות תענוגות, SARS-CoV-2 RNA זוהה 17 ימים לאחר שהנוסעים יצאו7. דגימות אוויר ומשטח מבתי חולים ומערכות הסעת המונים נמצאו חיוביות לסארס-CoV-2 ולנגיף קורונה אחר8,10,11,12,13,14. מחקר שנערך על האריזה החיצונית של ממתקי ליל כל הקדושים שטופלו על ידי חולי COVID-19 אסימפטומטיים ומתונים/סימפטומטיים במקצת, הגיע למסקנה כי השילוב של שטיפת ידיים על ידי המטפל ושטיפת הממתקים עם סבון ידיים הפחית את ה- SARS-CoV-2 RNA לרמותסף נמוכות יותר 15.
מספר שיטות לאבחון SARS-CoV-2 פורסמו בהתבסס על תגובת שרשרת פולימראז הפוכה בזמן אמת (RT-qPCR)16,17, הגברה איזותרמית בתיווך לולאה הפוכה (RT-LAMP)11,18,19,20,21, ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 ,19,22,22 , 20,ו CRISPR-Cas טכנולוגיות18, רובם דורשים ערכות מיצוי RNA שלעתים קרובות נמצאות במחסור בתקופות של ביקוש עולמי משמעותי, ומעט מאוד שימשו לבדיקה סביבתית של הנגיף24. הגילוי של SARS-CoV-2 RNA באמצעות RT-LAMP הוכח להיות מעל 83% קונקורדנטי לשימוש RT-qPCR. יתר על כן, RT-LAMP הביאה לירידה של 25% בתוצאות חד משמעיות בהשוואה ל- RT-qPCR15.
RT-LAMP היא טכניקה פשוטה המשתמשת שעתוק הפוך לסנתז cDNA מתבנית RNA25, ואחריו פולימראז DNA עם פעילות עקירת גדילים חזקה כי מסנתז DNA בטמפרטורה קבועה (כלומר, הגברה isothermal)26. ספציפיות גבוהה יותר של גילוי גנום ויראלי מושגת באמצעות ארבעה או שישה פרייומרים המזהים שישה או שמונה אזורים של ה- DNA היעד. הגברה מתחילה מפריימר פנימי ומניבה מבנה דנ”א דו-גדילי למחצה. הגדיל המוביל מוגבר לאחר מכן על ידי פריימר חיצוני. הגברות אלה חוזרות על עצמן עבור פריימרים הפוכים. פריימרים פנימיים וחיצוניים משני הקצה יש אתר פנימי הפוך משלים עצמי היוצר לולאה במוצר הגברה26,27. בתזוזת גדילים איסותרמית, סינתזת DNA אסינכרונית מייצרת כמויות גבוהות של מוצר מוגבר שבו פולמור מתמשך מגביר את האות של כמה 10 עותקים לכלתגובה 11,20,28. תערובת RT-LAMP הצבעונית היא מאגר חלש ומשתמשת באדום פנול כמחוון pH. כמו פולימראז משלב נוקלאוטידים, הוא משחרר פרוטון, מספיק פרוטונים ישנו את ה- pH של הפתרון, כמו גם את צבעו מוורוד לצהוב11,20,28,29.
RT-LAMP פותחה לגילוי מחלות המועברות על ידי יתושים במתקני בריאות היקפיים שאין בהם מעבדות מאובזרות25 ולזיהוי מהיר של נגיפי RNA אחרים כמו וירוס כשל חיסוני אנושי30. האוכלוסיות הפגיעות ביותר בהתפרצויות מגיפה – לפי הגדרת ארגון הבריאות העולמי – חסרות לעתים קרובות מספיק משאבים כלכליים ואת הציוד המתאים לביצוע איתור (סדר היום של האו”ם לבריאות הציבור העולמית). במגפת SARS-CoV-2 הנוכחית, אספקה כגון ספוגיות ברמה רפואית ריאגנטים עבור ערכות מיצוי RNA לא הצליחו לענות על הביקוש העולמי, במיוחד במדינות שאינן ייצור. הפרוטוקול המוצע השתמש בחילוץ RNA גולמי מבוסס guanidinium thiocyanate (GITC), אשר למעשה שימר את ה- RNA באופן עצמאי בשרשרת קרה והפחית באופן משמעותי את ההתמדה של מעכבים מהמדגם. יתר על כן, פרוטוקול החילוץ GITC-chloroform מבוסס על הפרדת RNA מ- DNA וחלבונים ואחריו המשקעים המתאימים, המאפשר התאוששות של רוב החומר הגנטי. יתרונות אלה עולים על הסיכונים הפוטנציאליים של מדענים אזרחיים המטפלים בכימיקל אם ננקטים אמצעים כדי ליידע אותם כראוי על הסיכונים.
זרימת העבודה המוצעת משתמשת בחומרים ובריאגנטים הנמצאים בשימוש כללי. זה דורש ציוד זמין בסיסי, לעתים קרובות כפרי, הגדרות מעבדה. שיטות אלה הן זולות, עמידות מאוד מעכבים נמצא לעתים קרובות דגימות סביבתיות או דגימות שלא ניתן לעבד עם ערכות החילוץ, ולחסל את הצורך תרמוציקלר דיוק גבוה. מחקר זה מציג צינור לדגימה וגילוי של SARS-CoV-2 ממאגרים סביבתיים על משטחים נפוצים שנגעו בהם ורק לעתים רחוקות מחוטאים של משקי הבית והסביבה העירונית.
מעורבות מדען אזרחי. מדענים אזרחיים גויסו למשטחי ספוגית ברחבי מחוז סן דייגו כדי לדגום ולזהות את נוכחותם של SARS-CoV-2 בסביבה העירונית. רוב ערכות הדגימה שנמסרו (70%) הוחזרו למעבדה, ומתואם כמעט כל הדגימות הושלמו (91%) (איור3א,B וטבלה 4). מתנדבים יכולים בקלות לבקש מסירה/איסוף של ערכות דרך הפלטפורמה מבוססת האינטרנט, ותוכנת תכנון מסלולי המסירה הודיעה למדענים אזרחיים על זמני ההגעה המשוערים, שניהם ככל הנראה גורמים משמעותיים להצלחה שנצפתה. הזמן הממוצע ממועד מסירת הערכה למדען האזרחי ועד להחזרתה למעבדה היה 8 ימים, עם חציון של 3 ימים וטווח של 1-64 ימים (איור 3A וטבלה 4). תזכורות תכופות יותר למתנדבים צפויות לקצר את זמן ההשהיה הזה.
פלטפורמת איסוף הנתונים שימשה בהצלחה את רוב המשתמשים (73%) (שולחן4). בעוד המאמצים של המדענים האזרחיים לא נמדדו, בדיקות שדה הראו כי פלטפורמת איסוף הנתונים צמצמה באופן משמעותי את המאמץ והזמן הנדרשים להשלמת איסוף מדגם כראוי. לפיכך, הפחתת כמות הנהלת החשבונות עודדה מעורבות של מדען אזרחי. הפלטפורמה מבוססת האינטרנט נועדה להתגבר על מגבלות דמוגרפיות על ידי מתן שירות תרגום מכונה עצבי רב לשוני ועל ידי מתן פרוטוקולים גרפיים אורקוליים באנגלית ובספרדית. זה היה מוצלח רק באופן חלקי כמו פחות דגימות נאספו הן סאות’ ביי ומחוז צפון שבו רוב האוכלוסייה ההיספנית / לטינו של המחוז מתגוררים45. אזורים אלה גם היו 63% (1,700 מקרים לכל 100,000) מכלל מקרי COVID-19 במחוז סן דייגו עם השכיחות הגבוהה ביותר של המחלה46 ושיעור האשפוזים(62%) 47,48. למרות שרוב הדגימות הגיעו ממחוז סנטרל, מספר מייצג נאסף מהמחוזות המושפעים ביותר מ- COVID-19 ורק חלק קטן מהדגימות היה חיובי, מה שמרמז כי מאגרי פני השטח של SARS-CoV-2 בסביבה העירונית הם נדירים יחסית.
עיבוד לדוגמה. ספוגיות דגימה היו רטובות עם SDS, אשר השבית את הנגיף על ידי שיבוש המעטפה שלה וייצב את RNA עירום על ידי נפרש RNases32. בנוחות במהלך האיסוף, חומר הניקוי בספוגית ניקה את המשטח שנדגם. דגימות סביבתיות מכילות לעתים קרובות כמויות קטנות מאוד של RNA. כדי למקסם את ההתאוששות, בידוד RNA בוצע בשיטת מיצוי גולמי מבוססת GITC, נטולת טורים. GITC, סוכן צ’אוטרופי חזק, משבש את קשרי המימן השומרים על קיפול חלבונים (כלומר, אפקט הידרופובי). פעולה זו גורמת להשבתה של חלקיקים ויראליים, ואת RNA נשאר יציב עקב עיכוב של RNAses34,35,36. פתרון GITC שמר על יציבות דגימות ה- RNA ללא שיקולים קפדניים של שרשרת קרה, מה שאיפשר לאזרחים לשמור על הדגימות בטמפרטורת החדר אם מקפיא לחפיסות הקרח שסופקו לא היה זמין. כדי להפחית את הסיכון הפוטנציאלי ריאגנט זה מהווה כאשר עור ישיר או מגע רירית מתרחשת, האזרחים היו מודעים לסיכונים אלה על ידי הכללת גיליון נתונים בטיחות חומר שסופק בערכה חותם אזהרה הונח בתיבה המכילה את הצינורות.
שיטת החילוץ הגולמית GITC-chloroform סייעה להתאוששות עקבות של RNA מהמטליות, וכפי שמוצג על ידי הגברה של דגימות ממוסמרות, מעכבים לעתים רחוקות התעקשו בדגימות לאחר החילוץ. דגימות, שהיו שליליות עבור SARS-CoV-2 ולא הראו עיכוב RT-LAMP, ייצגו תשלילים אמיתיים או היה מספר עותק נמוך יותר מאשר LOD בתדר 100%. לעומת זאת, זיהוי של RNA ויראלי על משטח אינו מרמז ישירות על הסיכון של שידור באמצעות מגע כמו הדבקות של הנגיף מדגימות חיוביות צריך להיבדק. סינון מהיר של הסביבה, לא מוגבל על ידי הזמינות של אספקה מתוחכמת או כוח אדם מוסמך מאוד, הוא חיוני כדי להעריך אם משטחים מהווים מאגר ויראלי כדי לשפר את מאמצי מניעה והכלה ישירה.
RT-LAMP נבחרה להיות השיטה הטובה ביותר המתאימה לצינור הזיהוי המוצע. זה הוכיח להיות שיטה מהירה וזולה כי היה עמיד מאוד לרוב המעכבים הנותרים רגיש וספציפי כמו שיטות אחרות RT-qPCR. בשל השימוש בהם בהגדרות קליניות במהלך מגפת SARS-CoV-2, הזמינות של ערכות RT-qPCR הושפעה מהביקוש העולמי. יתר על כן, טכניקות RT-qPCR – אפילו אלה שנוסחו כדי להתנגד למעכבים – היו רגישות לחומרים הכלולים בדגימות הסביבתיות שנאספו על ידי קבוצת פיילוט של מדענים אזרחיים, גם לאחר שימוש באסטרטגיות נפוצות אחרות להפחתת התחרות המעכבת על כריכתאנזימים 49. ממצאים אלה מאומתים על ידי מחקר שנערך לאחרונה שהשווה את שתי השיטות לגילוי SARS-CoV-2 על דגימות ספוגית מממתקים שטופלו על ידי חולי COVID-19 ומצא מעל 83% קונקורדנציה תוצאה, עם עיכוב נמוך ב -25% בדגימות שנותחו על ידי RT-LAMP15. יתר על כן, מיצוי גולמי GITC-כלורופורם, יחד עם RT-LAMP, הפחית את העלות של ריאגנטים ואספקה על ידי 42% לעומת מיצוי ערכת RNA ו RT-qPCR (שולחן החומרים).
שיטה זו אפשרה ניתוח תפוקה גבוהה של אלפי דגימות ספוגית פני השטח. עד 80 בריכות, המייצגות 640 דגימות, עובדו תוך יומיים מיצוי RNA לגילוי SARS-CoV-2 על ידי RT-LAMP. הפרוטוקול המוצע הוא חצי שוויוני, מוגבל לגילוי של RNA ויראלי, ואינו מצביע על נוכחות של חלקיקים נגיפיים זיהומיות. ניתוח נוסף נדרש כדי להעריך את הסיכון של העברת SARS-CoV-2 מ fomites נגוע נוכח על משטחים מנוקב.
מחקר זה מציג פרוטוקול כדי להגדיר במהירות אסטרטגיית בדיקה הכוללת זרימת עבודה יעילה כאשר מתמודדים עם מצב חירום בריאותי עם מחלה מדבקת. פרוטוקול הדגימה המוצע הוא פשוט ומשתמש באספקה הנפוצה במשקי בית, ושיטת הגילוי הנגיפית מתבצעת על ציוד הזמין בהגדרות מעבדה בסיסיות כגון אמבט מים במקום תרמוציקלר. העלויות של ריאגנטים RT-LAMP נמוכות משמעותית מאלה הדרושות עבור RT-qPCR ופחות רגישות לתרחישי ביקוש גלובליים גבוהים. מחקר זה משמש מסגרת להערכת מאגרים ויראליים סביבתיים בהתפרצויות מגיפות עתידיות ומגפות עולמיות.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחוקרי מכון המידע הוויראלי (VII), ד”ר אנקה מ. סגל, ווילו סגל, פטרישיה ל. רוהוור, גארי רוהוור, קארי ל. רוהוור, מגדה סילביה פינטה, אליזבת קרוז קאנו, ד”ר גרגורי פיטרס, ד”ר סטיוארט סנדין וד”ר ג’ניפר סמית’ על שהקדשו את הזמן לאיסוף דגימות רבות. אנו מודים גם לד”ר רוב נייט, ד”ר ג’ק גילברט, ד”ר פדרו באלדה-פרה וד”ר שרה אלארד מהמחלקה לרפואת ילדים באוניברסיטת סן דייגו קליפורניה (UCSD) על הקלת בקרות חיוביות ומשוב שימושי. אנו מודים לסטייסי קארוטה (SDSU College of Sciences) וג’ינה ספידדל (SDSU) על התמיכה הלוגיסטית ולחואן רודריגז על האמנות והעיצוב הגרפי של פרוטוקול הדגימה. אנו מודים לכל המשתתפים על מחויבותם ומסירותם לפרויקט בתקופות קשות מאוד. עבודה זו נתמכה על ידי תרומה נדיבה של ד”ר ג’ו אן ליין (SDSU המכללה למדעים) ואת הקרן הלאומית למדעים RAPID: מאגרים סביבתיים של מענק SARS-CoV-2 (מספר הפרס: 2030479).
SMP, LIMS, and community outreach: | |||
Authentication Application Programming Interface | Google Sign-In | ||
Commercial hosting platform | GoDaddy | ||
Data Charting Application Programming Interface | Google Charts | ||
Database software | MySQL | ||
Delivery route planning software | Circuit | Circuit for Teams | |
Free email service | Google Email | ||
Geospatial Application Programming Interface | Google Maps API | ||
Multilingual neural machine translation service | Google Translate | ||
Online form | Google Form | ||
Operating system | Linux | ||
Web and database development | Big Rose Web Design | ||
Web server software | Apache | ||
Sampling kit: | |||
Coolers | Coleman (Amazon) | B00363X3F2 | Cost (US$) per 100 rxns: 70 |
Gallon Ziploc bags | Solimo (Amazon) | B07BJ495GL | Cost (US$) per 100 rxns: 18 |
Glycerol (hand sanitizer) | FischerScientific | G33-4 | Cost (US$) per 100 rxns: 9 |
Ice packs | Ice-Brix (Amazon) | B075GLD3X1 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
Isopropanol (hand sanitizer) | FischerScientific | AA36644K7 | Cost (US$) per 100 rxns: 43 |
KN95 masks | Echo-Sigma | Echo-Sigma | Cost (US$) per 100 rxns: 400 |
Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet | Office Depot | 348037 | Cost (US$) per 100 rxns: 36 |
30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer) | Anyumocz (Amazon) | B07T64FHXR | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes | Genesee Scientific | 22-281 | Cost (US$) per 100 rxns: 83 |
Sample ID solvent resistant labels | LABTAG | XST-10C1-1WH | Cost (US$) per 100 rxns: 68 |
Swiffer WetJet pads (swabs) | Swiffer (Amazon) | B001F0RBT2 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Toothpicks | Kitchen Essential (Amazon) | B00PBK4NG6 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution – GITC), not LS | Invitrogen | 15596018 | Cost (US$) per 100 rxns: 40 |
Tube boxes | Genesee Scientific | 21-119 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
Small Ziploc bags | Ziploc (Amazon) | B01LRKEI9K | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Zebra Thermal Transfer Desktop Printer | Zebra | GK420t | |
Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160 | |||
Trizol RNA extraction: | |||
Ammonium Acetate RNase-free | Invitrogen | AM9070G | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
Chloroform | FisherScientific | C298-500 | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL) | Invitrogen | AM9515 | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol | FisherScientific | BP2818500 | Cost (US$) per 100 rxns: 30 |
Molecular-grade Isopropanol | FisherScientific | BP2618500 | Cost (US$) per 100 rxns: 3 |
TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
Multiplexed colorimetric RT-LAMP: | |||
Guanidine Hydrochloride | Alfa Aesar | AAJ6548522 | Cost (US$) per 100 rxns: 1 |
RT-LAMP E1-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
RT-LAMP N2-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG | NEB | M1800S | Cost (US$) per 100 rxns: 210 |
Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler | Eppendorf | 950030010 | |
Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470 | |||
Kit for RNA extraction: | |||
QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 61904 | Cost (US$) per 100 rxns: 570 |
RT-qPCR: | |||
Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Applied Biosystems | 4444432 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes | IDT | 10006713 | Cost (US$) per 100 rxns: 20 |
qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix | Quantabio | 95132-100 | |
QuantiNova Pathogen | Qiagen | 208652 | |
QuantiNova Probe | Qiagen | 208352 | |
UltraPlex 1-Step ToughMix | Quantabio | 95166-100 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855196 | |
Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 | |||
RT-PCR: | |||
SuperScript IV One-Step RT-PCR | Invitrogen | 12594025 | |
Lab cleanup: | |||
DNAZap | Invitrogen | AM9890 | |
RNAZap | Invitrogen | AM9780 |